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研究背景乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。目前临床上的治疗方法仍以传统手术和放、化疗为主。侵袭和转移是其主要特点,尤其是三阴性乳腺癌,对治疗药物不敏感、耐药快和易复发,这些都迫使我们亟需研发新的药物和寻找新的治疗方法。肿瘤的生长离不开肿瘤缺氧微环境,缺氧促进肿瘤的侵袭转移。一方面,缺氧区的肿瘤细胞能通过自身围绕成管状结构,与内皮细胞相通,形成血管生成拟态（Vasculogenicmimicry,VM）促进肿瘤的生长、转移和耐药。另一方面,肿瘤缺氧微环境促进上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的发生,EMT 由锌指转录因子（Zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1）等多种转录因子诱导发生,是肿瘤获得侵袭表型的早期步骤。在以上过程中,缺氧作为“启动开关”,使脯氨酸羟化酶2（Prolyl hydroxylases 2,PHD2）的活性被抑制,会导致缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）降解减少,入核增加,与核内的HIF-1β组成异源二聚体,从而激活缺氧信号通路,进而增加了肿瘤的侵袭迁移能力。PHD2是一种α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid,α-KG）依赖的双加氧酶,a-KG对维持PHD2的活性有着重要的作用。a-KG在体内由异柠檬酸脱氢酶（Isocitratedehydrogenase,IDH）合成。IDH包含三个亚型:IDH1,IDH2以及IDH3。目前已有文献报道在多种肿瘤组织中发现IDH1基因突变或表达水平的改变。但针对IDH1在乳腺癌中的作用研究较少。特别是在缺氧微环境下IDH1如何通过PHD2影响乳腺癌的侵袭转移和血管生成拟态的研究尚未见报道。阿可拉定（Icaritin）是从植物淫羊藿中提取、分离、纯化得到的活性单体淫羊藿素。作为我国自主研发的原创Ⅰ类新药,目前已获批上市用于晚期肝细胞癌的治疗。作为一种源于中药的小分子免疫调节剂,阿可拉定可作用于相关信号通路,发挥抗肿瘤效应。除肝细胞癌以外,阿可拉定对黑色素瘤、肾细胞癌也有一定抑制作用。但对乳腺癌的作用研究较少,对缺氧微环境下乳腺癌的侵袭转移和血管生成拟态的影响以及是否与IDH1/PHD2通路相关暂无文献报道。基于以上背景,本课题将分别从体外、体内水平开展以下研究:1.缺氧微环境下IDH1/PHD2对于乳腺癌转移、侵袭以及血管生成拟态的影响及调控机制。2.缺氧微环境下阿可拉定对乳腺癌的转移、侵袭和血管生成拟态的作用以及作用机制是否与IDH1/PHD2相关通路有关。实验方法和结果一、缺氧微环境下IDH1/PHD2对乳腺癌侵袭、迁移和血管生成拟态的调控1.生物信息学分析通过TCGA公共数据库分析发现,IDH1表达水平的高低与乳腺癌患者的生存期有关,处于不同分期的乳腺癌患者IDH1表达水平不同以及乳腺癌组织及正常乳腺组织中的IDH1蛋白表达有差异;通过GEO数据库分析发现正常乳腺细胞和乳腺癌细胞IDH1蛋白表达有差异。2.缺氧模型构建采用化学缺氧法加入连二亚硫酸钠构建体外缺氧模型,通过MTT实验筛选对细胞增殖影响较小的浓度,利用Western blotting检测HIF-1α表达,最终选定1mmol连二亚硫酸钠处理两种乳腺癌细胞,构建体外缺氧模型。3.IDH1在不同乳腺癌细胞中的表达Western blotting检测MDA-MB-231细胞以及MCF-7细胞IDH1蛋白的表达差异。结果发现,高侵袭性的MDA-MB-231细胞IDH1蛋白表达较低,低侵袭性MCF-7细胞IDH1蛋白表达较高。因此,后续实验采用IDH1过表达的质粒转染MDA-MB-231细胞,使用IDH1小干扰RNA转染MCF-7细胞。4.缺氧微环境下IDH1过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞影响使用IDH1过表达质粒转染MDA-MB-231细胞。通过克隆形成实验以及Transwell实验检测缺氧条件下IDH1过表达对MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移的的影响。结果发现:缺氧条件下IDH1过表达对MDA-MB-23 1细胞增殖无显著影响,IDH1过表达对MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移均有抑制作用。通过VM形成实验发现,IDH1过表达抑制MDA-MB-231细胞的VM形成。接下来,用Western blotting检测缺氧条件下,IDH1过表达对MDA-MB-231细胞相关蛋白 PI3K、VE-Cadherin、MMP-2、p-AKT、AKT、E-Cadherin、N-Cadherin和ZEB1表达的影响,以及对PHD2、HIF-1a的影响。结果发现IDH1过表达抑制 ZEB1、N-Cadherin、PI3K、p-Akt、VE-Cadherin、MMP-2 和 HIF-1a 的表达,使E-Cadherin和PHD2表达增加。接下来,为进一步探究IDH1过表达对PHD2-HIF-1α相关通路的影响,我们使用了 PHD2抑制剂IOX4和底物α-KG,结果发现IOX4能逆转IDH1过表达对MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用,α-KG可以抑制MDA-MB-231细胞迁移,抑制效果与IDH1过表达产生的作用相似。Western blotting检测发现,加入IOX4能显著抑制PHD2的表达,使HIF-1α表达增加;而加入α-KG能显著增加PHD2的表达,使HIF-1α表达减少。5.缺氧微环境下IDH1低表达对乳腺癌MCF-7细胞的影响使用IDH1小干扰RNA转染MCF-7细胞。通过克隆形成实验、Transwell实验检测缺氧条件下IDH1干扰对MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移的的影响,结果发现:缺氧条件下IDH1干扰对MCF-7细胞的增殖没有显著影响,对MCF-7细胞侵袭和迁移有促进作用。接下来,用Western blotting检测缺氧条件下IDH1干扰对MCF-7细胞侵袭转移和 VM 形成相关蛋白 PI3K、VE-Cadherin、MMP-2、p-AKT、AKT、E-Cadherin、N-Cadherin和ZEB1表达的影响,以及对PHD2、HIF-1a表达的影响。结果发现IDH1 干扰能促进 ZEB1、N-Cadherin、PI3K、p-Akt、VE-Cadherin、MMP-2 和HIF-1a的表达,使E-Cadherin和PHD2表达降低。随后,使用PHD2抑制剂IOX4和PHD2底物α-KG进一步考察IDH1干扰对PHD2-HIF-1α相关通路的影响,Transwell迁移实验结果发现α-KG能逆转IDH1干扰对MCF-7细胞迁移的促进作用,而加入IOX4后能促进MCF-7细胞迁移,与IDH1干扰的迁移促进作用相似。Western blotting检测发现,加入IOX4抑制PHD2的表达,使HIF-1α表达增加;而加入α-KG显著增加PHD2的表达,促进HIF-1α降解。二、缺氧微环境下阿可拉定对乳腺癌细胞的作用及机制使用阿可拉定处理乳腺癌MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞24h和48h,通过MTT实验检测存活率,结果显示,阿可拉定浓度为20μM时开始对细胞增殖产生明显抑制作用,因此选择阿可拉定对两种细胞增殖影响较小的浓度（5,10,15μM）进行后续实验。通过划痕实验、Transwell实验和VM形成实验检测结果显示,阿可拉定能显著抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移以及VM的形成。接下来为研究阿可拉定对乳腺癌细胞影响是否与IDH1/PHD2相关通路有关。在低氧环境下用IDH1过表达质粒转染MDA-MB-231细胞,再用阿可拉定处理细胞。Transwell实验结果显示,与阿可拉定组相比,阿可拉定+IDH1过表达组MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移能力均受到明显抑制。VM形成实验结果显示,与阿可拉定组相比,阿可拉定+IDH1过表达组MDA-MB-231细胞的VM形成显著减少。Western blotting实验结果显示,与阿可拉定组相比,阿可拉定+IDH1过表达组 MDA-MB-231 细胞 ZEB1、N-Cadherin、PI3K、p-Akt、VE-Cadherin、MMP-2和HIF-1a的表达降低,E-Cadherin和PHD2表达增加。接着,我们在低氧环境下用IDH1小干扰RNA转染MCF-7细胞,再用阿可拉定处理细胞。Transwell实验结果显示,与阿可拉定组相比,阿可拉定+si-IDH1组细胞的侵袭和迁移能力增强。进一步通过Western blotting实验结果显示,与阿可拉定组相比,阿可拉定+si-IDH1组细胞的侵袭转移能力增强,ZEB1、N-Cadherin、PI3K、p-Akt、VE-Cadherin、MMP-2 和 HIF-1a 的表达增加,E-Cadherin 和 PHD2表达降低。以上结果表明,阿可拉定对乳腺癌的作用机制是通过上调IDH1蛋白表达水平,增加PHD2蛋白表达水平,减少缺氧诱导的HIF-1α的积累,从而降低VE-Cadherin、N-Cadherin、MMP-2 的表达。三、体内实验选取19-21g（8周龄）的雌性BALB/c-nu裸鼠,随机分为Control组、Vector组、IDH1过表达组、Vector+阿可拉定组、IDH1过表达+阿可拉定组,每组5只。尾静脉分别接种未处理、空质粒转染或IDH1过表达质粒转染的MDA-MB-23 1-luc-D3H2LN细胞。灌胃给药生理盐水或阿可拉定（10mg/kg）,隔天给药,连续给药10次。记录裸鼠体重,使用小动物活体成像系统观察乳腺癌的肺转移情况。处死裸鼠后,取出肺组织,并在显微镜下观察肺转移结节,HE染色检测乳腺癌肺转移情况,CD34/PAS双染法检测VM的形成情况。结果发现,各组小鼠体重无显著差异。Control组小鼠肺部检测到发光强度,镜下有明显的肺转移结节,HE染色有大量肿瘤细胞,CD34/PAS双染法检测有VM形成。与Control相比,Vector组裸鼠肺部发光强度轻微降低、肺转移结节、HE染色、VM形成均无显著差异。与Vector相比,IDH1过表达组和Vector+阿可拉定组发光强度均较弱,肺组织转移结节较少,HE染色肿瘤细胞较少、很难发现VM形成。与Vector+阿可拉定组相比,IDH1过表达+阿可拉定组无发光,肺组织未找到转移结节,HE染色未发现肿瘤细胞以及VM形成。实验结论1.IDH1过表达可抑制缺氧微环境下乳腺癌的侵袭、迁移以及VM的形成,通过抑制PI3K/Akt通路上调PHD2的表达,促进HIF-1α降解。抑制侵袭转移和VM形成相关蛋白VE-Cadherin、MMP-2的表达和ZEB1介导的EMT过程。2.阿可拉定对乳腺癌侵袭、转移以VM形成均有较好抑制作用。机制是通过上调IDH1水平,抑制PI3K/Akt通路上调PHD2的表达,促进HIF-1α的降解,抑制侵袭转移相关的VE-Cadherin、MMP-2等蛋白表达和ZEB1介导的EMT过程而实现的。研究意义本课题从体内外水平探讨了缺氧微环境下IDH1/PHD2对乳腺癌侵袭、转移和血管生成拟态的影响及阿可拉定对乳腺癌的作用及机制,明确了阿可拉定可通过影响IDH1/PHD2/HIF-1α信号通路对乳腺癌的侵袭、迁移及血管生成拟态的形成产生较好抑制效果,为今后乳腺癌的治疗和药物研发提供了理论依据。