研究背景和目的乳腺癌是世界范围女性最常见的恶性肿瘤,占女性全部恶性肿瘤的22%左右,是危害女性健康的最主要的疾病之一[1]。乳腺癌曾经在中国等发展中国家发病率较低,然而随着社会、经济、环境等诸多因素的变化,乳腺癌的发病率在全球范围迅速增加,仅仅10年时间乳腺癌的总发病率提高了近10倍[2],乳腺癌在中国更是以每年2.7%的比例快速增长[3]。流行病学资料显示,基因的异常扩增和突变及遗传易感性改变在乳腺癌的发生过程中发挥了重要作用[4]。近年来随着对一些重要癌基因和抑癌基因生物学功能的不断深入研究,乳腺癌发生发展的分子机制被逐渐阐释[4]。基于新的癌基因和肿瘤靶标的靶向治疗也在乳腺癌的治疗中发挥了重要作用,随着分子分型及肿瘤精准医疗概念的提出,乳腺癌的研究正逐步从以往的循证治疗、经验治疗向新的以全基因组测序和基因突变为导向的个体化治疗转变,在这个大环境下,探索新的乳腺癌关键癌基因,发现其新的调控机制和生物学作用,并实现临床转化正成为近年来乳腺癌研究领域的重点和难点。尽管乳腺癌的诊断和治疗取得了一些进展,由于乳腺癌术后的远端复发和转移特性致使乳腺癌患者预后仍然不良,更好的认识乳腺癌的发病及进展的分子机制,挖掘乳腺癌生长和转移侵袭过程中的标志性癌基因对于开发出治疗转移复发性乳腺癌患者的新策略尤为重要。国内外已有研究表明,PRR11在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。富含脯氨酸蛋白PRR11(Proline-rich protein 11)基因位于人类染色体17q22区,生物信息学分析显示PRR11包含1个二联核定位信号,2个脯氨酸富集区域,和1个锌指结构域。脯氨酸富集基序可以和SH3域相连接,调节蛋白与蛋白之间的相互作用,参与细胞信号转导,引起一系列肿瘤相关事件;锌指结构域通过与双链DNA结合,调节基因的转录。该蛋白的作用靶标可能为膜蛋白受体、粘附分子、生长因子、转录因子、启动子等与肿瘤产生、增殖、侵袭及转移密切相关的蛋白及基因位点[5]。在之前的研究中,PRR11被认为是影响肿瘤细胞调节的一个不利因素,但是它的作用以及对人实体瘤的临床应用价值却鲜为人知。最近研究中,免疫组化技术被用来评估PRR11在6种胃肠肿瘤中的表达水平,发现PRR11的表达对肝门部胆管癌(HC)患者的临床病情有重要影响[6]。PRR11的表达情况亦在肺癌中被报道,研究人员发现PRR11在蛋白水平的表达与肺癌细胞周期的进展密切相关。在超过一半的肺癌标本中发现了PRR11的过表达[7]。进一步的研究还发现PRR11在实体瘤中有着广泛的表达,其中在食管鳞癌表达率最高占93.3%,肝癌最低占53.3%。这一结果证实此前关于PRR11在肺鳞癌高表达的研究是正确的[8]。通过对5种消化系统肿瘤中(食管鳞状上皮细胞癌,胃癌,十二指肠癌,结直肠癌及肝癌)对PRR11的表达分析显示,PRR11表达在五中肿瘤中有很明显的改变,同时发现PRR11与胃癌的不良预后密切相关。另据报道,Ji Ying等人发现PRR11在细胞周期进展和肿瘤发生中起重要作用,这个蛋白因其致癌性被看作是肺癌诊断治疗的一个潜在的新靶点[9]。通过调节与细胞周期及肿瘤发生相关的重要基因,PRR11参与了肺癌发生的起始与发病进程,也参与了乳腺癌上皮细胞的间质转型。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)最早在1982年由Greenberg和Hay提出[10],是指在特定的生理和病理情况下上皮细胞通过一系列改变向间充质细胞分化的现象,具体表现为上皮细胞丧失极性并获得间质表型,细胞间的连接及黏附能力下降或消失,细胞迁移和转移侵袭能力增加,细胞形态改变,以及细胞标志物表达水平的变化,如?-连环素(β-catenin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮细胞标志物表达下调,波形蛋白(vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、?-SMA等间质表型标志物表达增加等。EMT在胚胎发育、组织发生中发挥重要作用,并存在于多种慢性疾病的发病过程及肿瘤的浸润转移过程中。调控细胞EMT发生的分子机制比较复杂并涉及多条细胞信号转导通路,目前已报道的通路主要有TGF-?(14)BMP通路、PI3-K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Src通路及整合素通路等[11-13]。但是诱发EMT并调控相关通路的关键基因及其作用机制尚不明确,有待于进一步阐明。研究发现,乳腺癌细胞来源于乳腺上皮细胞,能够表达上皮细胞标志物,且存在上皮间质转化现象;亦有报道称在乳腺癌细胞系中上调间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)可以显著提高乳腺癌细胞系的转移能力,并与乳腺癌患者的不良预后密切相关。上述研究均提示EMT乳腺癌复发转移及不良预后过程中发挥着重要的作用。在我们的前期研究中通过对过度表达或干扰PRR11的乳腺癌MCF-7细胞系及其对照细胞系蛋白和基因水平的检测表明,PRR11与?-catenin表达呈正相关,提示我们PRR11在乳腺癌细胞系中可能正向调控Wnt/?-catenin通路,介导乳腺癌细胞EMT,进而增强其转移能力,并影响乳腺癌患者的预后。乳腺癌是对女性健康威胁最大的肿瘤之一,至今其调控机制仍不十分清楚,除了ER/PR、HER2、Ki67外尚,可用于临床诊断的预后标志物及治疗方面有效的分子靶点还很缺乏。因此寻找乳腺癌治疗靶标和预后标志物是目前乳腺癌研究的重要内容。PRR11作为一个重要的肿瘤相关信号调节蛋白,其对乳腺癌及生长转移的调控尚无报道。本课题将利用多种特征性乳腺癌细胞模型、肿瘤转移模型系统研究PRR11在乳腺癌生长和转移中的作用,揭示其对乳腺癌细胞生长转移的调控及分子机制,并利用大规模乳腺癌样本及其临床病理资料和随访信息,系统分析PRR11与乳腺癌临床病理特征和患者预后的关系,探讨PRR11作为乳腺癌预后标志物的应用前景,最终为乳腺癌的诊断和治疗提供新的靶标。第一部分PRR11在乳腺癌细胞和组织中的表达及其临床意义目的:检测PRR11在乳腺癌组织和细胞中的表达,分析PRR11表达与乳腺癌临床病理特征的相关性,探讨其预后预测意义。方法:采用免疫荧光、实时荧光定量PCR和免疫印迹检测PRR11在乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达。采用实时荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组织化学法检测乳腺癌组织与正常组织中PRR11的表达差异,明确乳腺癌组织中PRR11的表达与肿瘤分期、增殖指数、组织分级、分子分型等临床病理特征的相关性。通过生存分析和Cox风险比例回归模型探讨PRR11对乳腺癌患者预后的预测意义。结果:免疫荧光显示PRR11主要表达于乳腺癌细胞浆内。实时荧光定量PCR和免疫印迹结果提示,PRR11的m RNA和蛋白质在乳腺癌组织和细胞系中的表达明显高于正常乳腺组织和上皮细胞系。免疫组化结果显示,PRR11高表达的乳腺癌组织中增殖标志物Ki67的表达明显高于PRR11低表达的乳腺癌组织,PRR11的表达随着乳腺癌分期的提高而增加。PRR11的表达与肿瘤大小、远处转移、病理分期、孕激素受体状态密切相关,但与年龄和淋巴结状态无明显相关性。生存分析提示,PRR11高表达患者生存期较低表达者明显缩短,PRR11可作为乳腺癌患者独立的不良预后的预测指标。结论:PRR11在乳腺癌组织和细胞中的表达明显高于乳腺正常组织和上皮细胞,乳腺癌组织中PRR11表达与增殖指数、是否转移及肿瘤分期密切相关,其可作为PRR11可作为乳腺癌患者独立的不良预后的预测指标。第二部分PRR11表达调节对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响目的:探讨PRR11表达调节对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响方法:构建慢病毒体介导的PRR11过表达和沉默体系,实现对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系中PRR11表达的稳定上下调。采用MTT、Ed U、平板克隆和TUNEL实验检测PRR11表达调节对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。筛选PRR11稳定上调和沉默的乳腺癌MCF-7细胞及各自对照细胞,构建裸鼠皮下种植瘤模型,检测PRR11表达调节对体内肿瘤生长的影响。结果:细胞功能实验结果显示,PRR11过表达的乳腺癌细胞活力、Ed U阳性细胞百分比和平板克隆形成数目较对照组明显升高,PRR11表达下调后乳腺癌细胞的上述生物学行为较对照组明显受到抑制,且细胞凋亡数目较对照组明显增多。荷瘤裸鼠模型结果显示,PRR11表达上调后MCF-7细胞的成瘤体积、质量和Ki67的表达较对照组明显升高,PRR11表达下调后上述指标较对照组明显降低。结论:PRR11表达上调可促进乳腺癌细胞的增殖和体内成瘤能力;PRR11表达下调则会抑制乳腺癌增殖和体内成瘤,并可诱导细胞发生凋亡。第三部分PRR11表达调节对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响目的:探讨PRR11表达调节对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响方法:采用慢病毒体介导的PRR11过表达和沉默体系,实现对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系中PRR11表达的稳定上下调。采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测PRR11表达调节对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。检测PRR11表达上调后乳腺癌MCF-7细胞中上皮间质转化(EMT)相关标志物(E-cadherin、Fibronectin和Vimentin)的改变。结果:PRR11表达上调后,乳腺癌细胞的细胞划痕愈合率和侵袭数量较对照组显著提高,PRR11表达下调则会抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。PRR11表达上调后MCF-7细胞发生EMT改变,E-cadherin表达降低,Fibronectin和Vimentin表达升高。结论:PRR11表达上调可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力,并诱导细胞发生上皮间质转化,PRR11表达下调则会抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。第四部分PRR11调控乳腺癌细胞生长和转移的分子机制目的:探讨PRR11调控乳腺癌生长和转移的分子机制方法:选取MCF-7细胞,采用免疫印迹和荧光定量PCR检测PRR11表达调节β-catenin及其下游信号分子cyclin D1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表达的影响。通过双荧光素酶报告基因实验(TOP/FOP-flash)检测对PRR11表达调节对β-catenin作为转录因子活性的影响。采用小干扰RNA下调β-catenin的表达后,免疫印迹和荧光定量PCR检测β-catenin及其下游信号分子表达变化,TOP/FOP-flash检测β-catenin的转录因子活性,同时检测细胞增殖和侵袭变化,验证PRR11通过β-catenin通路调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭。采用免疫组化检测临床乳腺癌标本中的PRR11和β-catenin表达的相关性。结果:PRR11表达上调后,乳腺癌MCF-7细胞中β-catenin的总表达量和核内表达量均明显升高,其调控的下游基因cyclin D1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表达也较对照组升高,受β-catenin转录激活的质粒荧光强度(TOP/FOP)明显增强。反之,当PRR11表达下调后,上述分子的表达较对照组明显降低。当同时下调β-catenin的表达后,PRR11上调所引发的cyclin D1、c-myc和Vimentin表达增加被抵消,而E-cadherin表达则有所恢复。此外,PRR11上调所引起的TOP/FOP比值升高也被抵消,MTT和Transwell实验结果显示,β-catenin表达下调可以抵消PRR11过表达所引起的MCF-7细胞增殖和侵袭能力的增强。临床乳腺癌组织中PRR11和β-catenin的表达呈显著正相关(r=0.457,p<0.001)。结论:PRR11通过与β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞的生长和转移。