目的:钙离子通道是一组跨越细胞膜的蛋白质大分子,它严格控制着钙离子进入细胞的过程,产生维持细胞生理必需的电化学信号,在细胞病生理学方面有很重要的作用。钙离子通道阻滞药(Calcium Channel Blocker, CCB)可以选择性地抑制Ca2+经细胞膜上的钙通道进入细胞内,具有松弛血管平滑肌,减少末梢血管阻力,从而降低血压的作用,但脑、冠状动脉和肾血流量不减少。同时,此类药物也存在负性肌力作用,可抑制心肌的收缩力及传导。CCB种类很多,主要选择性地作用于L-型钙离子通道(L-type calcium channels, LTCC),结合部位在α1c亚单位,并根据其具体结合点,又分为三个亚类:二氢吡啶类、地尔硫卓类和苯烷胺类。二氢吡啶类药物(Dihydropyridines, DHPs)具有广泛的应用范围,例如在血管舒张、支气管扩张、抗动脉硬化、抗糖尿病、抗基因诱变以及抗惊厥等方面均有明显的药理学作用。最初DHPs是作为心血管疾病的治疗药物而被广泛应用,目前已逐渐在其他方面发挥其药理作用。比如,尼莫地平作为抗局部缺血的药物应用于阿兹海默病的治疗中,除此之外在治疗痴呆、偏头痛及脑出血后的血管痉挛等方面也均有作用。硝苯地平也可用于治疗偏头痛、肥厚性心肌病以及雷诺现象等。同时硝苯地平还可应用于糖尿病性神经病变的治疗。如何在利用此类药物最大功效的同时尽可能降低其副作用,对于临床治疗有着极其重要的意义。因此,钙离子通道的内部转化机制以及钙离子通道阻滞剂的作用机制成为本课题的研究重点。一般LTCC包括三种状态,即开放状态(open state, O),失活状态(inactivation state, I)以及关闭状态(close state, C)。其中失活过程又包括电压依存性失活(voltage dependent inactivation, VDI)及钙离子依存性失活(calcium dependent inactivation, CDI)两种。通道动力学研究显示DHPs类药物主要通过稳定通道的失活状态从而对通道发挥抑制作用,但其具体的机制尚不清楚。Timothy综合征(Timothy Syndrome, TS)是一类由钙离子通道损害导致的先天性疾病,有研究表明其LTCC的I-II linker部位的氨基端即α1c亚单位的第436位氨基酸——甘氨酸突变成了精氨酸(G436R)。这一突变型与野生型LTCC比较,主要差别在于VDI的速率显著减低。本课题主要以研究L-型钙离子通道失活状态的详细机制为突破口,通过使用基因突变型(Timothy Syndrome L-type calcium channel, TS-LTCC)通道与野生型(wild type L-type calcium channel, WT-LTCC)通道进行对比,对通道的失活过程进行定性分析,并探讨二氢吡啶类药物对通道失活的具体作用机制。方法:1通道蛋白的制备?1.1 LTCC的α2δ及β2亚单位的制备?1.2 LTCC的α1c亚单位的突变型G436R的制备2?细胞及LTCC蛋白质表达的准备?2.1 HEK293细胞的培养?2.2制备LTCC的α2γ及β2亚单位两者均稳定表达的细胞系?2.3野生型及突变型LTCC的表达?3应用膜片钳记录通道的各项数据?3.1电极管的拉制3.2细胞内液及各种细胞外液配制3.3实验程序设定3.4全细胞模式下记录通道的各项数据4膜片钳获得数据的分析4.1 VDI的分析4.2 Recovery的分析4.3 Nifedipine的dose-response曲线测定5统计学处理结果:建立了同时表达α2γ及β2亚单位两种蛋白质的稳定细胞系。很大程度上减小了因多种蛋白质同时转染几率的不同而造成的误差,使得数据的来源更加可靠。通过使用此稳定细胞系,分别瞬时转染绿色荧光蛋白(GFP)与野生型LTCC或突变型LTCC,从而将LTCC的3个主要亚单位α1c,α2δ及β2同时表达,得到完整的L型钙离子通道电流。此后,在膜片钳全细胞模式记录试验中得到的电流经过细胞外液改为钙通道阻断剂氯化镉之后完全消失,进一步验证实验所记录的电流正是L型钙离子通道的电流。所记录数据的分析:所有数据均应用IGOR6.0分析软件进行的分析计算,结果如下:1失活(inactivation)的相关分析1.1 Tau(τ)时间常数以τ来表示,代表通道失活的速率,其值越小,速率越快,反之亦然。LTCC有快失活及慢失活两种过程,两种通道的τ均根据双指数函数(biexponenntial function)条件经曲线拟合(fit)后得出。其中野生型LTCC的τ_fast为496.23 ms,突变型LTCC则为1270.51 ms。野生型LTCC的τ_slow为3016.11 ms,突变型LTCC则为6358.5 ms。1.2 R1及R20R1及R20分别代表通道失活开始1 s及20 s后残余的未失活部分占总体电流量的比例。野生型LTCC的R1及R20分别是0.29和0.004,而突变型LTCC的R1及R20则分别是0.67和0.08。1.3 Relative Af, As, A0Relative Af, As及A0分别代表在失活过程中快失活,慢失活以及未失活的部分所占整体的比例。野生型LTCC的Relative Af, As及A0分别为0.71,0.29及0.01。突变型LTCC的Relative Af, As及A0则分别为0.29,0.65及0.05。2复活(recovery)的相关分析LTCC复活过程也是由快复活及慢复活两种成分组成:2.1 Tau(τ)同上也是指时间常数。野生型LTCC的τ同上根据双指数函数条件经曲线拟合后得出。其中τ_fast为1.60s,τ_slow为13.40s。而突变型LTCC的τ则是根据单指数函数(single exponential function)条件经曲线拟合后得出的,仅有τ_slow一项,其值为25.90 s。2.2 Relative Af及AsRelative Af及As代表意义同上。经计算得出,野生型LTCC的Relative Af及As分别是0.21及0.74。而突变型LTCC的Relative As值为0.94,Relative Af不存在。3硝苯地平的剂量反应关系曲线(Dose-Response Curve)细胞外液成分加入硝苯地平,浓度分别为0.1 nM,1 nM,10 nM,100 nM,1μM以及10μM每毫升。记录这些条件下LTCC的电流抑制率,最后得出硝苯地平对于野生型及变异型LTCC的浓度反应关系曲线。两条曲线的半数抑制浓度(IC50)差别不大,均小于1 nmol/ml。说明硝苯地平主要是通过作用于LTCC的慢失活状态而发挥作用的。结论:1突变型LTCC与野生型LTCC相比较,快失活成分消失,慢失活成分仍然残留。2突变型LTCC与野生型LTCC对硝苯地平的敏感性无显著差别。3硝苯地平主要通过作用于通道慢失活过程,达到抑制LTCC的功效。