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mTOR信号通路在调控细胞生长增殖和代谢方面具有着重要的作用[1]。根据对免疫抑制药物雷帕酶素敏感性的高低可分为mTORC1和mTORC2信号通路,分别对应于mTORC1和mTORC2两类复合物[2],Sin1蛋白在后者中特异存在[3]。目前认为它与mTORC2复合物中另一特异组分Rictor蛋白相互作用,共同调节mTORC2复合物的稳定性和活性,进而调节下游AKT蛋白及更下游的FOXO蛋白的活性[4]。同时Sin1被发现参与MAPK信号通路,所以又被称为MAPKA1(mitogen-activated protein kinase associated protein 1)。目前普遍认为,Sin1蛋白的功能缺失会对肿瘤的发生发展起到一定的作用。研究表明,肿瘤细胞系中,Sin1蛋白有着广泛的表达[5]。因此,若能准确了解Sin1蛋白的功能,将会对癌症的治疗或延缓起到重要的理论指导作用。而功能的研究要以结构的解析为基础,因此了解它的晶体结构就显得尤为必要。本课题试图通过表达纯化Sin1蛋白来解析其蛋白结构,以期从原子水平上解释Sin1蛋白参与的众多相互作用。我们首先尝试在原核表达系统(E.coli)中表达。将Sin1成功构建到pSUMO3,pGEX-6p-1,pACYC-Duet-1三种原核表达载体,表达测试后发现将pSUMO3-Sin1质粒转入BL21(DE3)时,在一定条件下,可以得到理想量的可溶性形式的Sin1蛋白。通过酶切前后Sin1蛋白的N端是否带有pSUMO3载体自身表达的6个His标签来决定Sin1蛋白能否特异性地结合到Ni柱,以便进一步进行纯化。之后根据SDS-PAGE胶电泳考马斯亮蓝染色后显示的目的蛋白纯度来决定是否继续纯化。如需进一步纯化,可分别根据蛋白的等电点和分子量过离子交换柱和分子筛来得到高纯度(>90%)的目的蛋白。最后在高盐的条件下通过Superpose12得到Sin1的单一的二聚体形式。最终用晶体生长条件筛选试剂盒进行初筛。遗憾的是,目前还没有长出晶体,推测可能是由于稳定Sin1二聚体所需的高盐环境影响了蛋白的结晶。胶原蛋白是人体所有蛋白质中所占的比例最多的一类,接近30%。它是组建我们人体结构的钢筋,为机体提供足够的机械强度。其一级序列是重复的Gly-x-y,序列十分保守且简单。它的正确合成与组装需要众多的翻译后修饰,比如糖基化,羟基化等[6]。在内质网中的P3H1/CRTAP/CYPB羟化酶复合体可以利用P3H1羟化酶的活性来特异性地羟基化未折叠的胶原的前α链的Pro-986,其功能缺失会导致“成骨不全症(ostergenesis imperfecta)”的发生[7]。P3H1蛋白根据其功能可以划分为2个结构域:C端的P4HC羟化酶结构域和N端的未知结构域(含456个氨基酸)[8]。本课题试图通过表达纯化P3H1蛋白的羟化酶结构域P4HC来解析其蛋白结构,以期从原子水平上解释P3H1蛋白如何羟基化未折叠的胶原前α链,从而为后续的药物开发提供理论前提。我们首先尝试在原核表达系统(E.coli)中表达,将基因成功构建到pSUMO3,pET28a,pGEX-6p-1这三种原核表达载体。幸运地是,我们发现当将P4HC构到pSUMO3或pGEX-6p-1载体中并转入BL21(DE3)时,在一定条件下,都可以得到理想量的可溶形式的P4HC蛋白。通过酶切前后P4HC蛋白的N端是否带有表达载体自身表达选择标签,利用亲和层析柱(Ni柱/GST柱)及凝胶过滤层析纯化获得了高纯度(>90%)的目的蛋白。通过Superdex 75得到P4HC的单一的单聚体形式。最后用晶体生长条件筛选试剂盒进行初筛。不幸的是,目前还没有得到足够好的P4HC结构域蛋白的晶体,故还需进一步筛选。