研究背景一、糖尿病的危害性糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种最常见的内分泌代谢疾病，因其患病率高，危害巨大，已被世界卫生组织列为危害人类健康的第三大疾病。作为全球性的非传染性流行病，目前全世界约有2亿以上糖尿病患者，每年有300万以上糖尿病患者死亡，估计到2025年全球约有3．33亿糖尿病患者，而我国有9000万左右糖尿病患者。糖尿病不仅是影响人类健康的主要因素，同时也是影响社会经济生活的重要因素。据2002年的统计资料，美国每年的糖尿病医疗费用为1320亿美元，而我国的糖尿病医疗费用为188．2亿元人民币。糖尿病相关的经济、社会成本主要来自糖尿病并发症，2007年全球用于治疗和预防糖尿病的健康成本至少达2320亿美元。因此糖尿病不仅是人类健康的杀手，同时也耗费大量资金，给社会和个人带来沉重经济负担。二、糖尿病脑血管病变糖尿病主要危害在于长期慢性高血糖所导致的各种慢性并发症。其中最主要的是血管并发症，正如第64届ADA大会Banting奖得主Brownlee博士所言，如果没有血管并发症糖尿病将不再是一个重大的公共健康难题。75％的糖尿病患者死于糖尿病血管并发症，其中糖尿病性脑血管病变的致残、致死率居第二位，在糖尿病的总死因中，约10％是由于脑卒中引起的。而且血管并发症的致死率、致残率存在地区差异，东方人种糖尿病性脑血管病更为突出。研究发现香港和东京的脑卒中发生率很高，在日本糖尿病患者16．4％死于脑血管病，高于心血管病的致死率。国内报道，糖尿病患者25％死于脑血管病。糖尿病病人合并脑血管疾病是非糖尿病患者的2-4倍，脑卒中死亡的患者中，糖尿病是非糖尿病病人的2倍以上。糖尿病性脑血管病变以糖尿病性脑梗塞为主，其占糖尿病性脑血管病变的85％。糖尿病性脑血管病的患病率随着糖尿病病程的延长而增高，缺血性病变远多于出血性病变，尤以腔隙性脑梗塞为主，且易反复多次复发，因此糖尿病脑梗塞的防治是降低糖尿病死亡率，减少糖尿病致残率的关键环节。三、糖尿病脑血管病防治糖尿病脑血管病变的基础是动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS），因此糖尿病脑血管病变防治的关键是减少AS的发病因素。目前主要强调糖尿病的综合治疗，即降糖、降压、调脂及抗凝治疗。HbA1c每降低1％，既可降低脑卒中发生率12％。糖尿病治疗的综合达标有利于减少或减缓AS的发生发展，进而有利于减轻糖尿病脑血管病的危害。但是大量循证医学研究发现，大血管病变在糖尿病临床诊断之前即已存在，且随着糖尿病病情的进展而发展，上述治疗并不能完全预防或阻止脑卒中的发生。因此在糖尿病脑卒中发生时，如何科学地治疗，尤其是如何科学地控制血糖，进而减轻脑损伤改善预后，是我们临床工作中面临的重要课题。目前在糖尿病脑卒中的治疗中，有关血糖水平控制的标准一直存在争议。研究显示在非糖尿病患者中，急性高血糖引发急性脑卒中的发生率为12％至41％，急性高血糖亦可加重非糖尿病脑梗塞缺血损伤，故目前在糖尿病脑梗塞的临床治疗中常过分强调降低血糖的价值，但血糖过低致细胞内乏糖，可发生“脑乏糖”，亦可加重脑组织损伤。近期Sherwin教授的研究结果提示，糖尿病治疗过程中，尤其是使用胰岛素的患者，易发生未知觉低血糖，血糖愈低，低血糖的感受阈值愈低，因而极易发生低血糖损害，而受低血糖影响最大的器官是大脑。目前，国际上很多学术组织提出了脑卒中的治疗指南，并对血糖控制水平提出了相应建议。最新的三个指南分别是2004年日本的《脑卒中治疗指导原则》，2006年我国卫生部疾病控制司和中华医学会神经病学分会组织全国有关专家编写的《中国脑血管病防治指南》，2007年美国心脏病学会／卒中学会提出的《缺血性脑卒中治疗指南》。美国脑卒中治疗共识中强调血糖水平尽量正常化，中国指南中建议急性卒中患者有血糖增高时应使用胰岛素将血糖控制在8．3 mmol／L以下。但对于慢性高血糖的糖尿病患者，什么样的血糖阈值更利于受损脑组织功能的恢复，有利于改善预后，是非常值得进一步探讨的问题。四、糖尿病脑内葡萄糖转运及影响因素大脑几乎完全依赖于葡萄糖提供能量，葡萄糖从血循环中进入脑细胞内参与能量代谢主要经过两个过程：首先在GLUT₁的转运作用下通过血-脑屏障（BBB），然后在GLUT₃的作用下穿过神经元细胞的胞膜进入细胞内，因此GLUT₁又被称为“BBB葡萄糖转运子”，GLUT₃又被称为“神经元葡萄糖转运子”。BBB由毛细管内皮细胞、基膜及星形胶质细胞足突构成，内皮细胞紧密连接以防止小分子水溶性物质自由通过。葡萄糖进入脑内需通过内皮细胞腔面GLUT₁载体先携带葡萄糖从血中进入内皮细胞，而后非腔面载体再把葡萄糖从内皮细胞释放入脑间质。血糖浓度一般为5mM，内皮细胞葡萄糖浓度约为3．4mM，而脑细胞外液葡萄糖浓度约为2．7mM，从而促使葡萄糖顺浓度梯度持续移动。国外学者研究发现，在糖尿病状态下，慢性高血糖可引起细胞内糖转运的降调节，作为一种保护机制，这种降调节减少了糖的细胞内流，进而降低了高糖的细胞毒作用。大量研究显示这种降调节是由葡萄糖转运子（GlucoseTransporter,GLUT）介导的。另有研究已证实慢性低血糖可以引起GLUT₁和GLUT₃ mRNA及蛋白表达代偿性增高，即出现升调节。但调节脑内葡萄糖转运的GLUT₁和GLUT₃在糖尿病慢性高血糖状态下是否存在降调节还有争议。五、提出假设临床工作中，糖尿病患者血糖下降过快（即使其血糖水平仍远高于正常），即可发生“低血糖现象”，出现“神经乏糖”（neuroglycopenia）症状。这给我们提出一个问题：糖尿病患者不同于非糖尿病患者，合并脑梗塞时，血糖控制水平既不能过高，亦不能过低。血糖过高可因高血糖加重脑梗塞缺血损伤，过低（即使血糖水平高于正常）则会因相对低血糖而发生“脑乏糖”，进而加重脑组织损伤。但其机制是什么，是否与GLUT₁和GLUT₃降调节有关尚不清楚。假定脑内GLUT表达与血糖水平呈负相关，即慢性高血糖导致脑内GLUT₁和GLUT₃降调节，则提示糖尿病脑梗塞时，为改善脑细胞对葡萄糖的摄取利用，避免发生细胞内乏糖一“脑乏糖”而加重脑损伤，需要一个相对较高的血糖水平，以保证脑内基本的能量需要，进而改善脑缺血损伤及其预后。对于慢性高血糖的糖尿病患者，什么样的血糖控制阈值更利于受损脑组织功能的恢复，还是一个有待进一步研究的科学难题。本研究即欲利用大鼠糖尿病模型，探讨糖尿病状态下不同血糖水平脑内GLUT表达的变化，进而评价高血糖对脑内GLUT表达水平的动态影响。同时利用大鼠糖尿病脑梗塞模型，研究血糖水平、GLUT表达水平变化与脑梗塞损伤的关系。为临床糖尿病脑梗塞治疗找出合适的血糖阈作为血糖控制目标提供理论依据。研究目的利用大鼠糖尿病模型，探讨糖尿病状态下不同血糖水平脑内GLUT mRNA及蛋白表达的动态变化，进而评价高血糖对脑内GLUT表达水平的动态影响。利用大鼠糖尿病脑梗塞模型，研究脑梗塞前基础血糖水平、梗塞急性期血糖控制水平对脑梗塞体积的影响变化。探讨血糖水平、GLUT表达水平变化与脑梗塞损伤的量效关系关系。评价不同基础血糖控制水平下，糖尿病脑梗塞急性期，血糖水平变化对脑梗塞损伤的影响及可能机制。评价糖尿病脑梗塞时，基础血糖水平下降的合理幅度，及糖尿病脑梗塞急性期血糖控制的合理阈值。为临床糖尿病脑梗塞治疗找出合适的血糖阈作为血糖控制目标提供理论依据。研究方法第一部分建立Wistar大鼠糖尿病模型。设定5个实验组：对照组（NC组），糖尿病血糖未控制组（DM1组）、糖尿病血糖控制较差组（DM2组）、糖尿病血糖控制一般组（DM3组）和糖尿病血糖控制良好组（DM4组），每组10只。四个糖尿病组大鼠血糖分别控制在>16．7mmol／L、14～16．7mmol／L、10～14mmol／L和<10 mmol／L四个水平。利用RT-PCR技术测定GLUT1和GLUT3 mRNA表达变化情况利用免疫组织化学技术测定GLUT1和GLUT3 mRNA和蛋白表达变化情况第二部分建立Wistar大鼠糖尿病模型，并设定4个组别：对照组（NC组），DM1、DM2、DM3组血糖控制在>16．7mmol／L、10．0～14．0mmol／L和6．0～8．0mmol／L三个水平组。建立大鼠脑梗塞模型。采用改良Longa线栓法。大鼠脑梗塞模型亚组分组：将4组大鼠制备糖尿病脑缺血-再灌注损伤模型（MCAO／R）。在此基础上将各组按血糖控制水平进一步分为3个亚组。NC组分为NC_MCAO1、NC_MCAO2、NC_MCAO3三个亚组，通过皮下注射NPH或腹腔内注射50％葡萄糖，使血糖保持在高糖水平>8mmol／L、正常血糖水平、低糖水平2-3mmol／L；DMl组分为DM1_MCAO1、DM1_MCAO2、DM1_MCAO3三个亚组，通过调整皮下注射的NPH剂量使血糖维持在>16．7mmol／L、10．0～14．0mmol／L和6．0～8．0mmol／L；按照同样的血糖控制方法，将DM2和DM3组分别分为三个亚组，DM2_MCAO1、DM2_MCAO2、DM2_MCAO3：DM3_MCAO1、DM3_MCAO2、DM3_MCAO3。脑梗塞体积计算：再灌注72h后断头取脑制作脑片，行TTC染色后用图像分析系统分析各组脑梗塞体积比。统计学分析：统计数据采用SPSS11．0软件处理。所有数据均以x±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），均数问两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。变量间的相互关系采用直线相关分析。P<0．05为差异有统计学意义。结果第一部分1．与NC组相比，DM1、DM2、DM3、DM4组GLUT1 mRNA表达分别降低46．14％、37．42％、29．67％、19．33％（P均<0．001），GLUT3 mRNA表达分别降低66．83％、56．64％、47．16％、21．95％。差别均具有统计学意义（p均<0．001）。2．GLUT1与GLUT3 mRNA的表达与血糖水平之间均呈负相关，其相关系数分别为-0．946和-0．952（P<0．01）3。免疫组化染色显示NC组大鼠大脑BBB中GLUT₁及大脑皮层、海马CA区神经元细胞上GLUT₃阳性染色颗粒丰富，而DM1、DM2、DM3组GLUT₁和GLUT₃阳性染色颗粒明显减少，且DM₁组比DM2、DM3组减少更明显，DM4组与NC组相比也有减少，但与DM1、DM2、DM3组相比其减少程度明显减轻，差别均有统计学意义（p<0．01）。4．糖尿病大鼠大脑内微血管密度与正常对照组相比无明显改变（p>0．05）。第二部分1．脑梗塞体积变化的组内比较：（1）NC组三亚组组内比较及两两比较均有显著性差异（p<0．05）。脑梗塞体积变化的顺序由大到小依次为NC_MCAO3>NC_MCAO1>NC_MCAO2。（2）DM1组三亚组组内比较及两两比较均有显著性差异（p<0．01）。脑梗塞体积变化的顺序为DM1_MCAO1>DM1_MCAO3>DM1_MCAO2。（3）DM2组三亚组组内比较有显著性差异（p<0．05），两两比较DM2_MCAO1VS DM2_MCAO2和DM2_MCAO3有显著性差异（p<0．05）。脑梗塞体积变化的顺序为DM2_MCAO1>DM2_MCAO2、DM2_MCAO3。（4）DM3组三亚组组内比较有显著性差异（p<0．01），两两比较DM3_MCAO1VS DM3_MCAO2和DM3_MCAO3有显著性差异（p<0．05）。脑梗塞体积变化的顺序为DM3_MCAO1 >DM3_MCAO2、DM3_MCAO32．脑梗塞体积变化的组间比较：（1）糖尿病脑梗塞急性期高糖亚组（血糖>16．7mmol／L）间比较：DM1_MCAO1、DM2_MCAO1和DM3_MCAO1三组间比较无显著性差异（P>0．05）。（2）糖尿病脑梗塞急性期中糖亚组（血糖10．0～14．0mmol／L）间比较：DM1_MCAO2、DM2_MCAO2和DM3_MCAO2三组间比较有显著性差异（p<0．01），两两比较DM1_MCAO2 VS DM2_MCAO2和DM3_MCAO2有显著性差异（p<0．05）。脑梗塞体积变化的顺序为DM2_MCAO2、DM3_MCAO2>DM1_MCAO2。（3）糖尿病脑梗塞急性期低糖亚组（血糖6．0～8．0mmol／L）间比较：DM1_MCAO3、DM2_MCAO3和DM3_MCAO3三组间比较有显著性差异（p<0．01），两两比较DM1_MCAO3 VS DM2_MCAO3和DM3_MCAO3有显著性差异（p<0．05）。脑梗塞体积变化的顺序为DM1_MCAO3>DM2_MCAO3、DM3-（MCAO）3。（4）糖尿病脑梗塞急性期血糖未变化亚组问比较：NC_MCAO2、DM1_MCAO1、DM2_MCAO2、DM3_MCAO四组间比较有显著性差异（p<0．01）。两两比较：NC_MCAO2 VS DM1_MCAO1、DM2_MCAO2有显著性差异（p<0．05）；DM3_MCAO3VS DM1_MCAO1、DM2_MCAO2有显著性差异（p<0．05）。脑梗塞体积变化的顺序为DM1_MCAO1、DM2_MCAO2>DM3_MCAO3、NC_MCAO2。3．脑梗塞体积变化幅度的比较：脑梗塞急性期，血糖控制水平与脑梗塞体积密切相关。高血糖水平（血糖>16．7mmol／L）均可增加脑梗塞体积；低血糖水平（血糖6．0～8．0mmol／L）并不一定减少梗塞体积；而中等血糖水平（血糖10．0～14．0mmol／L）对梗塞体积影响幅度最小。4．脑梗塞体积变化与血糖水平间相关关系：脑梗塞前基础血糖水平与脑梗塞体积呈正相关，Spearman相关分析法r=0．941 p=0．000。结论第一部分1．慢性高血糖引起大鼠大脑内GLUT₁和GLUT₃ mRNA表达降调节。2．慢性高血糖引起大鼠大脑内GLUT₁和GLUT₃蛋白表达降调节。3．BBB GLUT₁表达的减少并非因为微血管密度的改变。4．糖尿病大鼠利用胰岛素控制血糖后，GLUT₁和GLUT₃ mRNA及蛋白表达均有所增加，其表达与血糖水平呈负相关。5．GLUT₁及GLUT₃表达的降调节是机体对长期高血糖的适应性调节，以避免过量的葡萄糖进入细胞内产生细胞损伤。糖尿病大鼠脑内，高血糖可以引起糖转运降调节，存在降调节自我保护机制，我们将之定义为：高血糖预适应机制（HGPA），以减低高糖毒性作用。第二部分1．脑梗塞时高血糖和低血糖均增加脑梗塞体积，加重脑组织损伤。2．糖尿病大鼠脑梗塞损伤与梗塞前基础血糖水平和梗塞后急性期血糖控制水平均密切相关。脑梗塞损伤与梗塞前基础血糖水平成正相关，即梗塞前基础血糖水平越高脑梗塞损伤体积越大。3．梗塞前基础血糖水平控制不良者，适当降糖是有利的，血糖水平升高或维持原血糖水平，均可能增加脑梗塞损伤体积。4．适当控制血糖后可减少脑梗塞体积，但并不能提示血糖控制得越低，脑梗死体积越小。血糖下降幅度过大亦可加剧脑梗塞损伤，其机制可能与脑内葡萄糖转运蛋白降调节有关。5．梗塞前基础血糖水平控制不良者，降糖幅度以4～6mmol／L为宜，一般情况下血糖控制阈值10．0～14．0mmol／L是安全的；梗塞前基础血糖水平控制良好者，宜维持原血糖水平。6．糖尿病状态下，脑内存在葡萄糖转运降调节代偿适应机制（HGIP），脑梗塞时，血糖控制正常化并不利于脑梗塞损伤的恢复。由于降调节代偿适应机制的存在，而且血糖下降时该机制不能及时解除，需要相对较高的血糖水平以便维持脑细胞能量代谢的需要。因此糖尿病脑梗塞时，血糖下降幅度过大或水平过低，均可能加重脑组织损伤。7．我们的研究结果可以解释临床相对低血糖现象。并为临床糖尿病脑梗塞的合理治疗提供基本的实验依据。有必要进行大量临床研究来明确GCT和最适血糖降幅。基础血糖水平控制愈好，糖尿病脑梗塞损伤愈轻。糖尿病脑梗塞前基础血糖水平控制不良者，降糖幅度以4～6mmol／L为宜；一般情况下血糖控制阈值10．0～14．0mmol／L是安全的。糖尿病脑梗塞急性期血糖控制水平正常化，并不利于脑梗塞损伤的恢复。糖尿病脑梗塞急性期血糖下降幅度过大或水平过低，均可能加重脑梗塞组织损伤。我们的研究结果可以解释临床相对低血糖现象。并为临床糖尿病脑梗塞的合理治疗提供基本的实验依据。有必要进行大量临床研究来明确GCT和最适血糖降幅。