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诺如病毒（Noroviruses,NoVs）是世界范围内引发非细菌性急性肠胃炎的主要病原体,贝类是NoVs传播的重要载体之一,人们感染NoVs的常常与生食贝类或者食用加热不彻底的贝类相关。我国是贝类养殖消费大国,NoVs污染贝类造成的食源性疾病,是贝类食品安全不容忽视的问题。然而,目前NoVs尚不可体外培养,贝类中污染的NoVs常因病毒含量少、基因型复杂、贝类成分干扰等原因,给贝类中NoVs含量、种类、分布等检测带来了困难;研究表明,牡蛎中存在类似人类组织血型抗原（HBGAs）的受体,可以特异性的结合牡蛎组织,但牡蛎中该受体与不同型别NoVs的结合机制尚不清楚。因此建立贝类中NoVs的快速检测和分群分型方法,开展类HBGAs检测和分布调查,研究NoVs胁迫下类HBGAs的变化与NoVs分布规律,探索牡蛎中NoVs与类HBGAs结合机制,对于开展贝类中NoVs准确检测、消费预警、安全控制和抗病毒牡蛎品种的选育等,保障我国贝类产业可持续健康发展具有重要的意义。本文以NoVs为研究对象,建立了基于SYBR Green I荧光定量的贝类中NoVs快速检测与分群的方法;建立了8种牡蛎中类HBGAs的检测方法,初步探索了牡蛎中类HBGAs的分布规律;开展了NoVs胁迫下牡蛎中类HBGAs的变化与NoVs分布研究;制备了6种主要NoVs毒株的P粒子,解析了牡蛎中类HBGAs的结合特性,筛选了NoVs P粒子蛋白特异性分子探针,为深入探明NoVs在牡蛎中的结合机制奠定了基础,具体研究结果如下:1.贝类中NoVs的快速检测与分群方法研究对比分析了6株主要流行的GI、GII诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选并设计了保守区域引物,优化建立了基于SYBR Green I荧光定量快速检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证,结果表明,引物P289/290可以同时检测GI、GII诺如病毒,SYBR Green I荧光定量检测方法在病毒103-109copies之间线性关系良好（R2=0.993）,熔解曲线Tm值能显著区分GI和GII不同基因群的诺如病毒（p<0.05）;120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。该方法成本低,检测快速,分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GI、GII诺如病毒的快速检测与分群。2.牡蛎中类HBGAs的检测方法与分布规律研究优化了ELISA反应中单克隆抗体的稀释浓度、二抗浓度,筛选了最佳洗板次数、封闭奶粉浓度、TMB显色时间等因素,显著降低了背景干扰,建立了8种类HBGAs的ELISA检测方法。应用建立的方法对240份牡蛎样品中类HBGAs的分布和检出率进行了分析,结果发现牡蛎鳃组织中的含有较多的A、H1和Leb型类HBGAs,消化道和外套膜中含有较多的A和H1型类HBGAs;全年的检测情况表明,A型类HBGAs分子在消化道、鳃和外套膜中的检出率最高分别为100%、93.33%和95%;H1型和Leb型类HBGAs在牡蛎鳃中的检出率较高分别为65.42%和89.58%;按照季节分类,牡蛎鳃、消化道、外套膜中的A型类HBGAs在四季中均有较高的检出率（≥85%）;而在闭壳肌中,A型类HBGAs高检出率在春季和冬季,分别为63.3%和68.3%;牡蛎鳃中Leb型类HBGAs在四个季节中有较高的检出率（≥71.7%）,在所有的牡蛎组织中H1、Lea、Lex、Ley、Pre等类HBGAs检出率均为春冬季节比夏秋季节高（p<0.05）;利用免疫组化方法对牡蛎不同部位中类HBGAs进行了定位,结果发现,牡蛎鳃、消化道和外套膜中A型类HBGAs分布明显;H1型类HBGAs在牡蛎鳃和消化道组织中分布明显,在外套膜中也有分布。综上所述,不同牡蛎组织中存在不同类型的类HBGAs,且类HBGAs分布呈现多态性,并受季节影响。3.诺如病毒胁迫下类HBGAs的表达与NoVs分布规律实验室环境中将牡蛎暴露于GI.3/GII.4型NoVs中,经过一定时间的生物性积累,检测不同牡蛎组织中的类HBGAs表达变化,结果发现,在污染GII.4 NoV后,A型类HBGAs的表达在牡蛎鳃、消化道、外套膜中显著增加;在牡蛎污染GI.3 NoV或GII.4 NoV或两者的混物后,牡蛎鳃和消化道组织中的H1型类HBGAs表达显著增加;使用荧光定量RT-PCR方法同时检测牡蛎不同组织中的NoVs含量,结果发现GI.3 NoV在牡蛎的鳃、消化道、外套膜、闭壳肌中均有检出,但主要分布在消化道中（1.50±0.17）×107 copies,闭壳肌中最少,甚至有2个结果低于检出限;GII.4 NoV在牡蛎的鳃、消化道、外套膜、闭壳肌也均有检出,主要分布在鳃和消化道分别为（8.31±0.56）×106 copies和（1.77±0.62）×106 copies;当牡蛎暴露于混合NoVs中时,GI.3 NoV主要分布在消化道（7.26±1.44）×106 copies,GII.4 NoV则分布在鳃和消化道中,含量分别为（4.48±0.65）×106 copies和（1.11±0.13）×106 copies。在人工污染牡蛎48 h后的海水中没有检出NoVs。综上所述,将GI.3、GII.4 NoVs暴露于牡蛎中,牡蛎选择性的富集NoVs,NoVs胁迫影响牡蛎类HBGAs的表达,该研究为探明NoVs与牡蛎HBGAs结合与调控奠定了基础。4.人工污染诺如病毒在牡蛎中的蓄积与分布特性在实验室控制环境条件下,人工污染GII.4 NoV养殖太平洋牡蛎,以探讨NoVs在太平洋牡蛎组织中的含量变化和分布特性。实时荧光定量RT-PCR结果表明:GII.4 NoVs在牡蛎外套膜中的含量比较稳定,在（8.75±0.36）×1049.12±0.49×104拷贝数之间;在牡蛎鳃中的含量先增加后减少,6 h到最高（1.15±0.15）×106拷贝数;在牡蛎消化道中含量逐渐增加,12 h（1.06±0.14）×106拷贝数并趋于稳定;24 h后主要分布于牡蛎的消化道组织中,净化对牡蛎体内富集的GII.4 NoV含量无显著影响。免疫组织化学结果显示,GII.4 NoV广泛分布在牡蛎外套膜边缘、鳃璧和消化道内壁上,其分布随时间变化趋势与实时荧光定量RT-PCR结果一致。本研究为进一步研究NoVs在牡蛎中的生物积累规律、特异性结合机制,从而开展牡蛎中NoVs预警监测和制定贝类净化方案提供参考。5.不同型别诺如病毒P粒子的制备与体外结合特性利用六株主要流行的NoVs的PGEX-4T-1-P表达菌体,经IPTG诱导、超声破碎细胞后表达带有GST蛋白标签的P粒子蛋白,经过琼脂糖凝胶4B对P粒子蛋白进行纯化,thrombin凝血酶去除GST标签,形成了二十四聚体的P粒子,成功制备GI NoVs P粒子大小32.6KDa,GII NoVs P粒子大小38KDa。利用制备的P粒子,体外与HBGAs结合实验表明,不同NoVs P粒子与人工合成寡糖H1型均有较强的结合,与其他类型具有结合多样性;不同NoVs P粒子均与O+分泌型唾液结合,所有类型的NoVs P粒子与非分泌型唾液（O-）均不结合,其他类型具有多样性结合;GI型（57397株、54108株、55063株）NoVs P粒子与牡蛎消化道组织提取液结合能力优势明显,GII型（57395株、F278株、L20株）NoVs P粒子与牡蛎鳃、消化道、外套膜均有较强的结合能力,这三组结果均与牡蛎中NoVs积累分布具有一致性,可以间接证明,牡蛎中存在与NoVs结合的类HBGAs结合物质,这一结果可为后期NoVs与牡蛎类HBGAs的结合提供参考。6.诺如病毒P粒子蛋白特异性分子探针的筛选及应用利用荧光适配体技术,针对制备的NoVs P粒子蛋白,筛选出了5组特异性探针,经过16轮的循环筛选,筛选出A1-3序列作为检测NoVs P粒子蛋白的特异性序列,优化的最佳的P粒子蛋白荧光适配体探针作用时间120 min,该序列特异性强,灵敏度高,对筛选得到了A3-1序列经过10种截短处理,筛选出了检测NoVs P粒子蛋白的特性强更强、成本更低的截短序列A1-3-10,为NoVs的检测奠定了新的思路和方法。