研究背景:前列腺癌(prostate cancer,PCa)是泌尿系统常见的恶性肿瘤。在美国,PCa已成为第一位危害男性健康的恶性肿瘤,死亡率排第二位。中国PCa的发病率也在逐年上升,已经成为影响我国男性健康的难题之一。PCa进展相对缓慢,对于局限性及局部晚期PCa来说,其5年生存率大于99%,而晚期患者的5年生存率明显降低至3 0%左右。由雄激素依赖性前列腺癌(hormone-sensitive prostate cancer,HSPC)向去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)的转化及肿瘤的远处转移是导致治疗效果不佳及生存率下降的主要原因,且目前仍缺乏有效的治疗手段。因此,抑制前列腺癌的转移并寻求新的治疗靶点,具有极为重要的意义。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在特定的生理或病理情况下向间充质细胞转化的现象,其特征通常是间充质细胞标记物如波形蛋白(vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)的表达上调和上皮细胞标记物如E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达下调。肿瘤细胞发生EMT可导致肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强,最终出现向骨骼、肺部等部位的转移,进而促进肿瘤的进展。研究表明前列腺癌的EMT在肿瘤进展、转移及治疗耐药中发挥关键作用。因此研究EMT在PCa转移中的作用,对PCa的治疗有重要意义。EMT通常由多种信号转导通路参与调控,如TGF-β/Smad,Wnt和ERK等信号通路。其中,TGF-β/Smad信号通路被认为是EMT发生的重要环节。在经典的TGF-β/Smad信号通路中,TGF-β与具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的Ⅰ型和Ⅱ型受体(TβRI和TβRⅡ)结合,磷酸化并激活Smad2和Smad3(R-Smad),Smad2/3复合物与Smad4(Co-Smad)蛋白相互作用,形成转录因子复合物,然后从细胞浆转移到细胞核以调节靶基因的转录。因此,阻断TGF-β/Smad信号通路可抑制肿瘤细胞的EMT过程,从而为前列腺癌的治疗提供靶点。丙戊酸钠(valproic acid,VPA)是一种广谱的抗癫痫药物,目前应用于成人和儿童癫痫的治疗。VPA为组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)Ⅰ类(Ⅰa,Ⅰb)和Ⅱ类(Ⅱa)抑制剂。研究表明,VPA除具有强大的神经递质调节功能外,还可在肿瘤细胞的周期调控、细胞分化、DNA修复、细胞凋亡及自噬中发挥作用,其潜在的抗肿瘤作用已被诸多研究证实。研究结果显示,VPA可诱导急性髓系白血病细胞的凋亡,并对乳腺癌细胞中具有强大的抗增殖作用。机制上,VPA可通过靶向HDAC1/2及HDAC1/PTEN/AKT信号通路介导的自噬抑制胃癌细胞的增殖;不仅如此,VPA还可通过调控胰腺癌细胞中的多种关键miRNA而下调EGFR、ErbB2和ErbB3的表达,从而导致下游AKT和MAPK信号通路失活,诱导细胞凋亡和生长停滞。上述研究揭示VPA通过复杂的调控机制抑制肿瘤的进展。但是,也有研究者发现VPA可促进肿瘤的发生发展。近期有研究表明VPA可通过稳定Snail,上调ZEB1的表达促进乳腺癌细胞的EMT。因此,我们推测VPA的作用效果具有明显的特异性,作用结局可能与肿瘤的类别、干预方式以及具体作用浓度、处理时间等具有很大的相关性。而我们以往的研究证实,VPA可以降低Smad4蛋白表达丰度以及升高其单泛素化水平,即VPA可通过双重作用来抑制PCa细胞的EMT,而VPA如何参与Smad4的单泛素化调节,其作用机制尚不明确。转录中介因子1y(TIF1γ),也称为TRIM33,属于E3泛素连接酶家族成员之一,参与DNA修复、细胞周期调控、免疫应答及炎症反应等。相关研究报道,TIF1y作为TGF-β超家族中的信号分子,在TGF-β/Smad信号通路中发挥重要作用。乳腺癌中有相关研究表明,FOXM1可通过与TIF1 γ竞争性结合Smad3/4的方式来阻止TIF1γ单泛素化Smad4,削弱TIF1γ对TGF-β信号通路的抑制作用,进而促进乳腺癌的转移;转录因子SOX2可通过抑制肺癌细胞TIF1γ启动子活性来抑制TIF1γ的蛋白表达,促进TGF-β/Smad信号通路诱导的EMT和肺癌的侵袭;而TiF1γ在前列腺癌中的研究尚未见报道。通过检索相关文献,结合我们之前的研究基础,我们提出假设,前列腺癌细胞中,TIF1y是否也以类似机制参与TGF-β/Smad信号通路诱导的PCa的EMT及侵袭转移?而VPA是否通过TIF1y发挥升高Smad4单泛素化的作用?这值得我们进一步研究。因此,本实验皆在探究TIF1γ是否是VPA抑制前列腺癌EMT的关键分子,并进一步探讨TIF1γ对TGF-β/Smad信号通路的作用及其分子机制,并结合体内实验进一步验证,为前列腺癌的临床治疗提供新的靶点。研究目的:1.在进一步验证VPA抑制前列腺癌细胞EMT的基础上,探讨TIF1y是否介导了这一过程,并行体内实验进一步验证,从而为前列腺癌的治疗提供新的思路。2.探讨TIF1γ对Smad4的作用及分子机制,明确其在TGF-β/Smad信号通路的作用,为VPA在前列腺癌中的临床应用提供科研依据。研究方法:第一部分:丙戊酸钠通过TIF1γ介导的TGF-β/Smad信号通路抑制前列腺癌EMT的作用机制研究1.TIF1 γ在VPA抑制前列腺癌EMT、迁移及侵袭中的作用研究1.1.VPA对前列腺癌细胞EMT的影响的探究选择人前列腺癌细胞系作为主要研究对象,包括雄激素敏感性前列腺癌细胞-LNCaP细胞和雄激素抵抗性前列腺癌细胞--PC3细胞。体外培养LNCaP、PC3细胞,根据课题组以往的研究结果,选择2.4mmol/L的VPA干预48h作为实验条件。细胞干预结束后,利用Western Blot(WB)方法检测EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin的蛋白表达情况,分析VPA对前列腺癌细胞EMT的作用及影响。1.2.TIF1γ对前列腺癌细胞EMT的影响的探究采用基因调控TIF1γ的方式探究TIF1γ对前列腺癌细胞EMT的影响。首先构建TIF1γ敲减及过表达的慢病毒。慢病毒感染LNCaP、PC3细胞后,应用嘌呤霉素、杀稻瘟菌素进行细胞筛选,从而建立稳定感染的细胞株。利用高内涵显微镜观察感染效率,qRT-PCR及WB实验检测TIF1γ的mRNA及蛋白表达,并计算TIF1y的沉默效率及过表达效率。最终选取效果最佳的LNCaP及PC3细胞稳转株,进行后续实验。同时使用negative control(NC)组作为病毒感染的对照组。在此基础上,为明确TIF1y对前列腺癌细胞EMT的作用,设置如下分组:TIF1y敲减相关实验分组为对照组(sh-NC)和TIF1γ敲减组(sh-TIF1γ);TIF1y过表达相关实验分组为对照组(NC)和TIF1γ过表达组(TIF1γ)。利用WB实验检测 PC3、LNCaP 细胞的 EMT 指标 E-cadherin、N-cadherin、vimentin 的蛋白表达,从而明确TIF1γ的表达变化对PC3、LNCaP细胞EMT的影响。1.3.VPA对TIF1 丫表达影响的研究体外培养前列腺癌LNCaP、PC3细胞,采用不同浓度的VPA干预,探究VPA对TIF1 γ表达的影响。进行如下实验分组:对照组,1.2mmol/L组,2.4mmol/L组。细胞传代后,各实验组根据预先设计的浓度加入VPA干预48h。利用WB方法检测TIF1y蛋白的表达情况。观察VPA对TIF1y蛋白表达的影响,并根据实验结果选取合适的VPA浓度作为后续研究的观察点。1.4.TIF1 γ在VPA抑制前列腺癌细胞EMT、迁移及侵袭中的作用的探究为明确TIF1 γ在VPA抑制前列腺癌细胞EMT中的作用,我们在VPA干预的基础上,设计针对TIF1γ的挽救实验来明确TIF1γ的作用效果。首先设计LNCaP、PC3细胞的TIF1 γ敲减相关实验,进行如下实验分组:对照组(sh-NC)、VPA干预组(VPA)、TIF1γ敲减组(sh-TIF1γ)、TIF1γ敲减VPA干预组(sh-TIF1 γ+VPA)。之后设计LNCaP、PC3细胞的TIF1 丫过表达相关实验,进行如下的实验分组:对照组(NC)、VPA干预组(VPA)、TIF1 γ过表达组(TIF1γ)、TIF1γ过表达VPA干预组(TIF1 y+VPA)。各组细胞按照预先实验要求分别体外培养,干预组给予VPA干预48h。利用WB检测各组EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin及vimentin的表达变化,从而明确TIF1 γ在VPA抑制前列腺癌细胞EMT中的作用。同理,transwell实验检测VPA干预的基础上,TIF1 γ的表达变化对VPA抑制前列腺癌细胞迁移及侵袭中的作用。实验分组同上。各组细胞分别体外培养,干预组给予VPA干预48h后,transwell实验观察各组细胞迁移及侵袭的变化,从而明确TIF1 γ在VPA抑制前列腺癌细胞迁移及侵袭中的作用。2.TIF1y介导VPA抑制前列腺癌EMT的机制研究诸多研究表明TIF1y可通过调控Smad4的单泛素化水平参与TGF-β/Smad信号通路并发挥抑制肿瘤细胞EMT的作用,为进一步探究TIF1γ介导VPA抑制前列腺癌EMT的机制,我们进行如下的实验设计,探究TIF1γ是否通过升高Smad4的单泛素化水平,进而促进Smad3/Smad4的解离来发挥介导VPA抑制前列腺癌EMT的作用。实验分组如下:sh-NC组、VPA组、sh-TIF1γ组、sh-TIF1γ+VPA组。体外培养各实验组PC3细胞,并给予VPA干预48h。采用免疫共沉淀的方法首先检测VPA的干预对Smad4的单泛素化水平及Smad3/Smad4复合物表达水平的影响,明确VPA是否通过上调Smad4的单泛素化进而促进Smad3/Smad4复合物的解离来抑制前列腺癌的EMT。进一步地,在VPA干预的基础上,给予TIF1γ的敲减表达处理,免疫共沉淀的方法检测Smad4的单泛素化水平及Smad3/Smad4复合物表达水平,从而明确TIF1 γ是否是VPA抑制前列腺癌EMT的关键分子及其分子机制,即VPA是否通过TIF1 γ发挥其升高Smad4的单泛素化水平及降Smad3/Smad4复合物水平的作用,进而抑制TGF-β/Smad信号通路诱导的前列腺癌的EMT。第二部分:丙戊酸钠通过TIF1y抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的增殖及EMT的研究1.TIF1 γ介导VPA抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤增殖的作用研究选取3-4周龄的雄性裸鼠48只,随机分成8组,每组6只,进行如下的实验设计:①TIF1γ敲减表达相关实验分组为:sh-NC组、VPA组、sh-TIF1 γ组、sh-TIF1 γ+VPA组;②TIF1γ过表达相关实验分组NC组、VPA组、TIF1y组、TIF1 γ+VPA组。前列腺癌PC3细胞、敲减及过表达TIF1γ的稳转PC3细胞分别裸鼠成瘤,干预组给予0.4%(w/v)VPA灌胃处理,每次1OOul,对照组给予等量无菌去离子水灌胃,干预时间为2周。成瘤及VPA干预期间,每周两次测量瘤体的长径及短径,并计算瘤体体积。观察VPA干预对移植瘤增殖的影响及TIF1 γ的表达变化是否影响VPA对移植瘤的作用。2.TIF1 丫介导VPA抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤EMT的作用研究2.1.VPA对前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的EMT影响的研究利用上述移植瘤组织标本,WB实验分别检测NC组、VPA组或sh-NC组、VPA组的E-cadherin、N-cadherin及vimentin的表达变化,进行各组之间的半定量分析比较,探究VPA对裸鼠移植瘤EMT的影响。2.2.TIF1 丫对前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的EMT影响的研究WB 实验检测 sh-NC 组、sh-TIF1γ 组及 NC 组、TIF1γ 组的 E-cadherin、N-cadherin及vimentin的表达变化,进行各组之间的半定量分析比较,探究TIF1 y的表达变化对裸鼠移植瘤EMT的影响。2.3.VPA对前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的TIF1 丫表达影响的研究为探究VPA对裸鼠移植瘤TIF1 γ表达的影响,WB实验检测NC组、VPA组或sh-NC组、VPA组的TIF1γ的表达丰度,进行半定量分析,明确VPA干预对移植瘤组织TIF1 γ表达的影响。2.4.TIF1γ对VPA抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤EMT影响的研究为明确移植瘤组织中,TIF1 γ的表达变化对VPA抑制前列腺癌EMT的影响,设计实验分组如下:①TIF1γ敲减表达相关实验分组为:sh-NC组、VPA组、sh-TIF1γ组、sh-TIF1 γ+VPA组;②TIF1 γ过表达相关实验分组NC组、VPA组、TIF1γ组、TIF1 y+VPA组。WB实验检测各实验组EMT相关指标,包括E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达,观察TIF1 γ的敲减或者过表达对VPA抑制裸鼠移植瘤EMT的作用的影响。同时,裸鼠移植瘤组织标本行免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测,观察各实验组TIF1 γ、E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达情况,检测VPA及TIF1 γ对移植瘤EMT的影响、VPA对TIF1 γ表达的影响、TIF1 γ的表达变化对VPA抑制移植瘤EMT的作用的影响。实验结果:第一部分:丙戊酸钠通过TIF1γ介导TGF-β/Smad信号通路抑制前列腺癌的EMT1.TIF1 γ介导VPA抑制前列腺癌细胞EMT的作用过程1.1.VPA可抑制前列腺癌细胞的EMTVPA以2.4mmol/L的浓度干预前列腺癌LNCaP、PC3细胞48h后,WB实验测定E-cadherin、N-cadherin、vimentin的蛋白表达。结果显示,VPA干预后,LNCaP、PC3细胞的E-cadherin表达明显上调,N-cadherin及vimentin的表达明显下调,与对照组比较,差异有统计学意义。上述结果表明,VPA可抑制前列腺癌细胞的EMT并发挥重要的抗肿瘤作用。1.2.TIF1 γ在抑制前列腺癌细胞EMT中发挥重要作用敲减及过表达TIF1 γ的LNCaP、PC3细胞稳转株构建成功,高内涵显微镜观察转染效率大于90%。qRT-PCR及WB方法检测TIF1 γ的mRNA及蛋白的表达情况。结果显示,敲减效率大于80%,过表达效率大于150%。比较各稳转株敲减及过表达效率,LNCaP细胞选择敲减稳转株sh-TIF1γ-2及过表达稳转株TIF1 y-3进行后续实验;PC3细胞选择敲减稳转株sh-TIF1 γ-2及过表达稳转株TIF1γ-2进行后续实验。WB实验检测TIF1 γ的敲减表达或过表达对LNCaP、PC3细胞EMT的影响。结果显示,敲减TIF1 γ的表达可下调LNCaP、PC3细胞E-cadherin的表达,上调N-cadherin、vimentin的表达,与sh-NC组比较,差异有统计学意义;TIF1γ的过表达可上调LNCaP、PC3细胞E-cadherin的表达,下调N-cadherin、vimentin的表达,与NC组比较,差异有统计学意义。表明TIF1 γ在前列腺癌细胞的EMT中发挥抑制作用。1.3.VPA上调前列腺癌细胞TIF1 丫的蛋白表达不同浓度的VPA干预LNCaP、PC3细胞48h后,WB实验检测TIF1 γ的蛋白表达情况。结果显示,VPA可明显升高前列腺癌PC3、LNCaP细胞TIF1 y蛋白的表达,并具有浓度依赖性,当VPA浓度为2.4mmol/L时,作用最为明显。1.4.TIF1γ介导VPA抑制前列腺癌细胞EMT的作用过程为明确TIF1γ对VPA抑制前列腺癌细胞EMT的影响,在VPA干预LNCaP、PC3细胞基础上,敲减TIF1 γ的表达,WB实验观察E-cadherin、N-cadherin、vimentin表达的变化。结果显示,在LNCaP及PC3细胞中,敲减TIF1γ的表达后,VPA的干预并未上调E-cadherin的表达及下调N-cadherin、vimentin的表达,说明敲减TIF1 γ的表达削弱了 VPA的抑制EMT作用;相反的,在VPA干预LNCaP、PC3细胞的基础上,过表达TIF1 γ,结果显示:E-cadherin的表达上调及N-cadherin、vimentin表达下调趋势更为明显,说明TIF1γ的过表达增强了VPA的抑制EMT作用。综合以上数据说明,VPA可能通过TIF1 γ抑制前列腺癌细胞的EMT。细胞迁移及侵袭实验也显示,VPA可抑制LNCaP、PC3细胞的迁移及侵袭能力。敲减TIF1 γ的表达后,LNCaP、PC3细胞的迁移及侵袭能力明显增强,过表达TIF1 γ后迁移及侵袭能力受到抑制。TIF1 γ敲减表达后,VPA的抑制前列腺癌细胞迁移及侵袭的作用减弱;而过表达TIF1γ后,VPA的抑制前列腺癌细胞迁移及侵袭的作用增强。这些现象也表明了 VPA可能通过TIF1γ抑制前列腺癌细胞的迁移及侵袭。2.TIF1 γ通过TGF-β/Smad信号通路介导VPA抑制前列腺癌细胞的EMT为探究TIF1 γ是否通过升高Smad4的单泛素化水平、促进Smad3/Smad4的解离来抑制TGF-β/Smad信号通路,介导VPA抑制前列腺癌细胞的EMT的作用,免疫共沉淀实验检测Smad4的单泛素化水平及Smad3/Smad4复合物水平。结果显示,VPA的干预可升高PC3细胞的Smad4的单泛素化水平,降低Smad3/Smad4复合物水平。敲减TIF1 γ的表达,Smad4的单泛素化水平降低,Smad3/Smad4复合物水平升高。而在VPA干预的基础上敲减TIF1 γ的表达,并未出现Smad4的单泛素化水平的升高及Smad3/Smad4复合物水平的降低,说明TIF1γ的表达下调可能阻断了 VPA的作用。因此我们推测,TIF1 γ可能通过TGF-β/Smad信号通路在VPA抑制前列腺癌细胞的EMT过程中发挥重要作用。第二部分:丙戊酸钠通过TIF1γ抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的增殖及EMT1.TIF1 γ介导VPA对前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的增殖抑制作用测量各实验组裸鼠移植瘤长径及短径,比较各实验组荷瘤小鼠的肿瘤体积。结果显示,对照组肿瘤的平均体积为0.72±0.12cm3,而VPA干预2周后的肿瘤平均体积为0.44±0.11cm3,差异具有统计学意义,说明VPA可抑制PC3细胞移植瘤的增殖。sh-TIF1 γ组肿瘤体积明显增大,平均为0.91±0.24cm3,与sh-NC组比较,差异有统计学意义;TIF1 γ组肿瘤体积明显缩小,平均为0.48±0.09cm3,与NC组比较,差异有统计学意义,说明TIF1γ具有抑制裸鼠移植瘤的增殖的作用。sh-TIF1γ+VPA组肿瘤的平均体积为0.54±0.10cm3,与VPA组相比较,差异有统计学意义,表明TIF1γ的表达下调减弱了 VPA的抑制增殖作用;而TIF1 丫+VPA组肿瘤的平均体积为0.37±0.04cm3,与VPA组及TIF1 γ组相比较,差异均有统计学意义,说明TIF1 γ的过表达促进了 VPA的抑制增殖作用。上述结果表明,VPA可抑制PC3细胞裸鼠移植瘤的增殖,TIF1 γ介导了 VPA的抑制增殖作用。2.TIF1 γ介导VPA抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤EMT的作用2.1.VPA抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的EMT利用PC3细胞裸鼠移植瘤组织标本,进行WB实验,观察VPA干预后E-cadherin、N-cadherin 及 vimentin 的表达变化,结果所示:VPA 干预后,E-cadherin的表达明显上调,N-cadherin及vimentin的表达明显下调,与对照组比较,差异具有统计学意义。说明在体内实验中,VPA亦可发挥其抑制前列腺癌EMT的作用2.2.TIF1 γ在抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的EMT中发挥重要作用为进一步观察移植瘤中TIF1 γ对EMT的影响,WB实验检测敲减及过表达TIF1 γ后 E-cadherin、N-cadherin、vimentin 的表达变化。结果显示,TIF1 γ 敲减后,E-cadherin表达明显降低,N-cadherin、vimentin的表达明显升高,说明抑制TIF1 γ的表达可促进移植瘤的EMT。相反的,过表达TIF1 γ上调了 E-cadherin的表达,下调了 N-cadherin、vimentin的表达,说明TIF1 γ的过表达抑制了移植瘤的EMT。以上结果说明,在体内实验中,TIF1γ作为肿瘤抑制因子,可抑制前列腺癌的EMT。2.3.VPA可上调前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的TIF1γ的表达比较对照组及VPA组移植瘤组织TIF1 γ的蛋白情况,进一步检测体内实验中VPA对TIF1γ表达的影响。WB实验结果显示,VPA干预可明显上调移植瘤TIF1 γ的蛋白表达,与对照组比较,差异有统计学意义。2.4.TIF1γ介导了 VPA抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤EMT的作用过程WB方法检测各实验组E-cadherin、N-cadherin及vimentin的蛋白表达,比较在VPA干预的基础上,TIF1 γ的敲减表达或过表达对上述指标的影响,进一步明确TIF1 丫的表达变化对VPA抑制移植瘤EMT的影响。结果显示,在|sh-TIF1 γ+VPA组中,抑制TIF1 γ的表达后,VPA干预并没有出现E-cadherin表达的明显上调及N-cadherin、vimentin表达的下调,与VPA组相比较,差异有统计学意义,表明下调TIF1 γ的表达可能阻断了 VPA的抑制EMT作用。而在TIF1 丫+VPA组中,VPA干预过表达TIF1 γ的移植瘤,E-cadherin上调及N-cadherin、vimentin下调趋势更为明显,表明TIF1 γ的表达上调促进了 VPA的抑制EMT作用。同样的,免疫组化实验也得到了与WB相近的结果。以上结果提示,TIF1 γ介导了 VPA抑制PC3细胞裸鼠移植瘤EMT的作用过程。结论:1.明确了 VPA抑制前列腺癌细胞EMT的作用,并揭示TIF1γ是VPA抑制前列腺癌EMT的关键分子。体内实验进一步证实,TIF1 γ介导了 VPA抑制前列腺细胞裸鼠移植瘤的增殖及EMT。2.明确了 TIF1 γ通过促进前列腺癌细胞Smad4的单泛素化,进而抑制Smad3/Smad4复合物的形成来调控TGF-β/Smad信号通路诱导的前列腺癌的EMT。