斜带石斑鱼IL-8及其受体基因的克隆、表达

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在实验室已建的斜带石斑鱼头肾SMART cDNA文库的基础上,对IL-8及IL-8R1基因进行了克隆及序列分析。结果表明,斜带石斑鱼IL-8基因cDNA全长1143bp,其中5’非编码区(5’-UTR) 345bp,3’非编码区(3’-UTR) 507bp,开放阅读框(ORF)291bp,编码96个氨基酸残基,包括23个氨基酸残基的信号肽和73个氨基酸残基的成熟肽;氨基酸同源比对发现,斜带石斑鱼IL-8与黑鲷IL-8的同源性最高,为95%,其次为花鲈和舌齿鲈,同源性分别为93%和91%,与红鳍东方鲀、褐牙鲆、锦鲤、虹鳟IL-8的同源性分别为为86%、77%、69%、59%,而与软骨鱼纲的皱唇鲨IL-8的同源性只有53%。斜带石斑鱼IL-8R1基因cDNA全长1505bp,其中5’非编码区(5’-UTR) 37bp,3’非编码区(3’-UTR) 394bp,开放阅读框(ORF)1074bp,编码357个氨基酸残基,包括62个氨基酸残基的信号肽和295个氨基酸残基的成熟肽;氨基酸同源比对发现,斜带石斑鱼IL-8R1和鳜鱼CXCR1的同源性最高,为82%,其次为红鳍东方鲀和褐牙鲆,其同源性分别为70%和68%,虹鳟和锦鲤IL-8R1与斜带石斑鱼IL-8R1的同源性分别为65%和55%。另外,设计简并引物对IL-8R2片段进行扩增,克隆得到中间片段531bp,编码177个氨基酸。氨基酸同源比对结果发现,斜带石斑鱼IL-8R2与红鳍东方鲀IL-8R2的同源性最高,为81%,其次为虹鳟IL-8R,同源性为54%。以PET21a为载体,构建了IL-8和IL-8R1的原核表达质粒,并成功在大肠杆菌中表达了含6个组氨酸标记的斜带石斑鱼IL-8和IL-8R1重组蛋白, Tricine SDS-PAGE表明斜带石斑鱼IL-8的重组蛋白分子量为9.1kDa。SDS-PAGE表明斜带石斑鱼IL-8R1的重组蛋白分子量为34.34kDa。利用Real-time PCR对溶藻弧菌感染和苯酚、CdCl2、CuSO4处理后的斜带石斑鱼IL-8及IL-8R1、IL-8R2在头肾、脾脏、肝脏、肾脏、肠、心脏、鳃等组织中的表达差异进行研究,发现经溶藻弧菌感染和10ppm苯酚、50ppm CdCl2、2ppm CuSO4处理后,IL-8的表达量均出现不同程度的上调;另外,IL-8及IL-8R1、IL-8R2在斜带石斑鱼各组织中均有表达,只是在表达的相对量上存在差异,其中IL-8在头肾表达量最高,IL-8R1和IL-8R2分别在脾脏和肝脏的表达量最大。
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