NK细胞是一种起源于骨髓前体细胞的大颗粒淋巴细胞,是机体重要的固有免疫细胞。当机体受到病毒感染或肿瘤生长和侵袭时,NK细胞被快速招募到受损的组织器官中,清除受感染细胞或发生恶变的细胞;NK细胞还可通过产生的细胞因子,调节免疫细胞功能。激活素A（Activin A）属于转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族因子,可由多种免疫细胞产生,如单核巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞以及Th2细胞等,参与多种免疫细胞功能调节。IL-9（Interleukin-9,IL-9）是一种重要的促炎细胞因子,主要由Th9细胞产生。但是,NK细胞能否产生Activin A及IL-9?Activin A对小鼠NK细胞功能又有何影响?仍不清楚。因此,本研究首先分析小鼠NK细胞是否能产生Activin A及IL-9,同时确定小鼠NK细胞是否属于Activin A应答细胞,进而揭示Activin A通过自分泌/旁分泌方式调控小鼠NK细胞活性作用及其相关机制。一、研究方法1.细胞因子检测采用细胞内细胞因子染色方法检测Balb/c小鼠NK细胞产生的Activin A、IL-2、IL-9、IL-10及IFNγ,ELISA法检测小鼠NK细胞分泌成熟Activin A及IL-9水平。2.激活素受体检测免疫双荧光染色及流式细胞术分析激活素II型受体（ActRIIA及ActRIIB）在小鼠NK细胞表面的表达。3.Smad3基因敲低实验采用pGCsi-U6/Neo-GFP对照质粒和pGCsi-U6/Neo-GFP-Smad3 shRNA表达质粒分别转染小鼠NK细胞,检测敲低Smad3基因表达对Activin A刺激的小鼠NK细胞产生细胞因子的影响4.IIA^high和IIA^lowNK细胞亚群分析采用流式细胞术检测小鼠外周血、淋巴结、脾脏及肝脏ActRIIA^high(IIA^high)NK和ActRIIA^low(IIA^low)NK细胞比率。吉姆萨染色观察流式细胞术分选的IIA^high和IIA^lowNK细胞形态学特征,BrdU法检测IIA^high和IIA^lowNK细胞增殖能力,与YAC-1细胞共孵育检测细胞杀伤活性,贴壁法检测细胞粘附能力。NS-1细胞移植瘤内注射Activin A,流式细胞术检测Activin A体内作用对移植瘤内IIA^highNK细胞比率的影响。二、研究结果1.小鼠NK细胞分泌Activin ART-PCR结果显示,小鼠NK细胞不仅表达ActivinβA mRNA,也表达ActRIIA、ActRIIB及Smad2,3,4 mRNA。细胞内细胞因子染色显示,小鼠NK细胞内存在Activin A蛋白表达。ELISA检测结果显示,IL-2可以促进体外培养NK细胞分泌成熟Activin A。2小鼠NK细胞表达激活素受体免疫双荧光染色显示Balb/c小鼠NK细胞同时表达NK细胞标志CD49b和ActRIIA,流式细胞术进一步证实Balb/c小鼠CD3^-CD49b⁺NKp46⁺NK细胞表达ActRIIA及ActRIIB。3.Activin A对NK细胞活性的影响研究显示Activin A可下调小鼠NK细胞IFNγ产生,但却上调IL-2产生,而对IL-10的产生没有影响。BrdU增殖试剂盒检测结果显示,IL-2可以明显促进NK细胞增殖及杀伤活性,而Activin A则对NK细胞增殖具有抑制作用,但对杀伤活性没有明显影响。作为阳性对照的CXCL12能促进小鼠NK细胞黏附,Activin A也能增加NK细胞黏附。4.激活素A抑制小鼠NK细胞IL-9表达细胞内细胞因子染色结果显示,小鼠外周血和脾脏CD3⁺CD4⁺Th细胞和小鼠外周血和脾脏CD3^-CD49b⁺NKp46⁺NK细胞均表达IL-9。Activin A可以促进小鼠CD4⁺Th细胞产生IL-9,但却显著抑制NK细胞IL-9产生。Western blotting结果表明,Activin A明显上调小鼠NK细胞ActRIIA、Smad3及p-Smad3蛋白水平。添加激活素A阻断剂Follistatin（FST）或敲低Smad3基因均可以减弱Activin A对IL-9释放的抑制作用。5.IIA^high和IIA^lowNK细胞亚群特征流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结、肝脏NK细胞,结果显示,不同组织器官中的NK细胞均有不同程度的ActRIIA（IIA）表达,据此可将NK细胞分为IIA^high与IIA^low两个亚群。研究显示小鼠IIA^highNK细胞CD25、精氨酸酶1（Arg1）及诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达量均高于IIA^lowNK细胞;而IIA^lowNK细胞CD11b表达量高于IIA^highNK细胞。研究还显示IIA^highNK细胞IFNγ、IL-2、IL-10及IL-9产生能力强于IIA^lowNK细胞;IIA^highNK细胞亚群杀伤活性强于IIA^lowNK细胞亚群;自然状态下两者增殖能力没有区别,而IL-2作用的IIA^lowNK细胞亚群比IIA^highNK细胞亚群具有更强的增殖能力,IIA^lowNK细胞比IIA^highNK细胞具有更强的粘附能力。体内实验显示,NS-1细胞移植瘤内注射Activin A,可以明显增加瘤内具有杀伤活性的IIA^highNK细胞比率。三、结论综上所述,小鼠NK细胞既是Activin A来源细胞,也是Activin A应答细胞;NK细胞还是IL-9来源细胞,Activin A可以促进CD4⁺Th细胞产生IL-9,但却抑制NK细胞产生IL-9,提示激活素A作用于不同细胞产生不同的生物学效应;依据激活素IIA型受体表达可将小鼠NK细胞分为IIA^high及IIA^lowNK细胞亚群,两个亚群细胞生物学特征和活性均不同。上述资料提示,Activin A作为NK细胞重要的调控因子,可能通过自分泌或旁分泌的方式调控NK细胞功能,但有关NK细胞亚群的生理病理学意义,仍有待进一步深入研究。