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目的:探讨不同免疫状态下,乙型肝炎病毒本身蛋白HBeAg对人外周血单个核细胞(PBMC)表面共刺激分子CD83、PD-L1、Toll样受体9、CD8细胞活化相关分子及细胞因子IFN-γ、IL-10的影响,进一步阐明HBe Ag对免疫细胞功能影响及其在乙型肝炎病毒感染慢性化过程中的机制。方法:从南昌大学第一附属医院感染科门诊及住院部收集感染HBV后免疫耐受期、免疫清除期患者各20例,另从健康体检者中严格筛选出20名健康者作为对照,收集其外周血分离PBMC,完全培养基温育作为未刺激对照组,重组HBe Ag温育作为HBe Ag刺激组,CPG-ODN1826温育作为CPG-ODN1826刺激组,重组HBeAg刺激组联合CPG-ODN1826温育作为联合刺激组。采用流式细胞技术检测各组CD14+细胞表面CD83、PD-L1及CD8+细胞表面CD107a、CD107b的表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测TLR9-mRNA的表达,酶联免疫吸附实验(Elisa)检测Th1型细胞因子IFN-γ及Th2型细胞因子IL-10的表达。结果:1、用不同浓度(1ug/ml、4ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)HBe Ag与健康人PBMC共培养0、2、6、12、24、48 h后发现,TLR9 mRNA及CD14+细胞表面CD83表达水平下降,而PD-L1的表达水平则升高,尤以10μg/mL浓度的HBe Ag刺激12 h时作用最明显;随着培养时间的延长上述各种表面标记逐渐恢复,至24h时已基本恢复到刺激前的水平。2、RT-PCR结果:健康对照者、免疫耐受患者、免疫清除患者PBMC经10μg/ml的重组HBe Ag刺激12h后,TLR9-mRNA表达水平(0.362±0.021、0.342±0.019、0.394±0.031)均低于未刺激组(t值分别为-7.62、8.85、11.63,P均<0.05),明显低于CPG-ODN1826刺激组(t值分别为-23.54、-37.45、-30.91,P均<0.05),差异有统计学意义;有低于重组HBeAg联合CPG-ODN1826刺激组的趋势(t值分别为-1.22、-1.78、-1.59,P均>0.05),但差异无统计学意义。3、流式细胞仪检测CD14+细胞表面CD83及PD-L1表达结果:(1)三组研究对象PBMC经重组HBe Ag刺激后,CD83表达水平[(18.69±5.43)%、(15.09±2.62)%、(21.26±4.34)%]低于未刺激组(t=3.84,6.35,4.55,p均<0.05),明显低于cpg-odn1826刺激组(t=-6.42、-9.57、-7.18,p均<0.05),差异有统计学意义;有低于联合刺激组的趋势(t=-1.22、-1.78、-1.59,p均>0.05),但差异无统计学意义。(2)pd-l1表达水平[(79.01±6.08)%、(80.57±4.21)%、(70.64±4.56)%]明显高于未刺激组(t=-5.78、-2.19、-5.16,p均<0.05);高于cpg-odn1826刺激组(t=7.93、11.72、6.87,p均<0.05)],差异有统计学意义;有高于联合刺激组的趋势(t=1.79、1.89、2.01,p均>0.05)但差异无统计学意义。4、流式细胞仪检测cd8+细胞表面cd107a、cd107b表达:(1)三组研究对象pbmc经重组hbeag刺激后,cd107a表达水平[(5.73±2.15)%、(4.15±0.79)%、(7.54±2.18)%]低于未刺激组(t=2.90、5.51、2.73,p均<0.05)],明显低于cpg-odn1826刺激组[t=-5.88、-5.06、-7.25,p均<0.05],差异有统计学意义;有低于联合刺激组的趋势(t=-0.78、-1.72、-1.83,p均>0.05),但差异无统计学意义。(2)cd107b表达水平[(1.59±1.06)%、(0.84±0.43)%、(2.15±0.45)%]低于cpg-odn1826刺激组(t=-4.38、-3.37、-4.87,p均<0.05),差异无统计学意义;有低于未刺激组的趋势(t=1.21、2.08、1.79,p均>0.05),有高于联合刺激组的趋势(t=-1.88、-1.53、-1.99,p均>0.05),差异无统计学意义;(3)三组患者经不同刺激物温育后,cd107表达水平趋势与cd107a一致,但cd8+t细胞比例无明显改变,差异无统计学意义。5、elisa结果:(1)三组研究对象pbmc经重组hbeag刺激后,th1型细胞因子ifn-γ表达水平[(75.42±7.04)、(71.59±5.55)、(101.64±9.93)]低于未刺激组(t=.86、3.15、5.88,p均<0.05),明显低于cpg-odn1826刺激组(t=-7.70、-4.94、-9.50,p均<0.05),差异有统计学意义;有低于联合刺激组的趋势(t=-0.93、-0.62、-0.58,p均>0.05),差异无统计学意义;(2)th2型细胞因子il-10表达水平[(61.67±7.42)、(54.57±7.29)、(84.96±11.74)]高于未刺激组(t=-6.87、-4.59、-7.63,p均<0.05)明显高于cpg-odn1826刺激组(t=9.33、8.23、9.61,p均<0.05),差异有统计学意义;有高于联合刺激组的趋势(t=1.93、1.79、1.98,p均>0.05),差异无统计学意义。结论:hbv可能通过hbeag作用于机体免疫细胞,不仅可以下调tlr9、正性共刺激分子cd83,上调负性共刺激分子pd-l1的表达,干扰免疫细胞对hbv抗原的识别以及递呈能力来抑制非特异性免疫反应,而且可降低hbv抗原特异性T淋巴细胞活性,抑制Th1型细胞因子IFN-γ及促进Th2型细胞因子IL-10的产生,进而减弱特异性免疫应答能力,使HBV逃避宿主的免疫清除,其可能是导致HBV感染慢性化的机制之一。