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围产期母羊需要将血液中大量的钙输送到胎儿或乳汁,主要的钙源是骨钙流失,但体内动员骨钙流失的自适应机制有一定滞后,使得血钙得不到及时补充,因此极易发生临床或亚临床低血钙症。该病很容易引发乳腺炎、酮病、代谢性碱中毒等多种其他疾病,导致母羊产奶量降低,乳品质下降,羊羔生长受阻,严重时导致母羊死亡。因此,低血钙症是围产期奶山羊极易发生的代谢性疾病,在生产中造成巨大的经济损失,对奶山羊产业发展具有严重危害。五羟色胺(5-HT,5-hydroxytryptamine),又名血清素,动物体内由L型色氨酸经色氨酸羟化酶(TPH1,Tryptophan 5-hydroxylase 1)催化合成,是一种单胺类神经递质,被认为是一种哺乳期骨转换的调节器,在诱导骨调节因子、维持骨密度、引发骨重塑方面发挥着重要作用;产前挤奶可以促进奶牛体内5-HT提前合成,缓解体内动员骨钙流失的自适应机制滞后的问题,由此减少低血钙症发生。由此推测,产前注射五羟色氨酸(5-HTP,5-hydroxytryptophan)或进行产前挤奶处理可能有助于维持围产期奶山羊钙代谢平衡,减少低血钙发生率,但相关研究尚未见报道。本研究旨在通过奶山羊活体试验和细胞水平试验探究5-HT对围产期奶山羊钙循环的影响及其分子机制,为阐明5-HT对围产期奶山羊血液中Ca浓度的调控机制积累资料,为寻找新的预防奶山羊围产期低血钙症的有效方法提供依据。首先给奶山羊分别在产前7 d开始注射5-HTP或产前挤奶处理,检测比较奶山羊血清及羊奶中5-HT、Ca、甲状旁腺相关蛋白(PTHrP,Parathyroid Hormone-related Protein)的浓度变化,并分析三者之间的相关性;然后用离体培养的原代山羊乳腺上皮细胞,应用CRISPR/CAS技术构建TPH1基因稳定敲除的山羊乳腺上皮细胞系;以原代山羊乳腺上皮细胞和TPH1基因稳定敲除的山羊乳腺上皮细胞系为试验材料,RT-PCR检测不同5-HT水平下山羊乳腺上皮细胞中钙转运关键基因的表达丰度,激光共聚焦成像技术检测细胞中Ca的含量。获得主要结果如下:1.围产期奶山羊血清中及羊奶中5-HT、PTHrP及Ca浓度两两之间存在相关关系;奶山羊产前注射5-HTP后,产后0-3 d血液中5-HT和PTHrP浓度高于对照组,羊奶中PTHrP和Ca浓度高于对照组;奶山羊进行产前挤奶处理后,产后0-3 d山羊血清中PTHrP浓度高于对照组。2.利用CRISPR/CAS技术在山羊TPH1基因第一外显子成功打靶并产生10bp碱基缺失,首次获得了TPH1基因稳定敲除的山羊乳腺上皮细胞细胞系。3.体外细胞试验研究发现,野生型山羊乳腺上皮细胞中添加5-HTP处理能够促进SPCA2 mRNA表达、降低PMCA1mRNA表达,对SPCA1及SRECA2mRNA表达没有影响;与野生型山羊乳腺上皮细胞相比较,在敲除TPH1基因山羊乳腺上皮细胞中PTHrP、SPCA1、PMCA1的mRNA表达降低,SRECA2 mRNA表达没有变化;在敲除TPH1基因的乳腺上皮细胞中添加5-HTP能够使敲除细胞中SPCA1 mRNA表达恢复、PMCA1、SPCA2及SRECA2 mRNA表达不变;激光共聚焦钙成像结果表明,5-HT能够促进山羊乳腺上皮细胞内离子钙外排,TPH1基因敲除后钙离子外排受到抑制。综上所述,5-HT在调控围产期奶山羊钙循环代谢过程中具有重要作用,产前注射5-HTP或产前挤奶均有助于提高血清中PTHrP浓度,可能是预防围产期奶山羊低血钙症的潜在方法;5-HT可能通过调控乳腺上皮细胞中PTHrP、PMCA1、SPCA1、SPCA2钙转运关键基因表达促进细胞内Ca外排。