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肝细胞癌,简称肝癌,是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,我国每年死于肝癌的人数约为11万,占全世界肝癌死亡人数的45%,严重威胁着我国公民的身心健康。肝癌起病常隐匿,初期症状不明显,多在肝病随访中或者体检普查中应用甲胎蛋白(AFP)以及B型超声波检查中被发现。此时病人的体格检查缺乏肿瘤本身的体征,这段时期称之为亚临床期。但是,肝癌一旦出现症状,大多是已进入中晚期。临床上一般采用西医的手术、放化疗与中药结合治疗等方法,但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低,且各种放化疗手段对患者都造成极大的毒副作用。而异体移植治疗法,受供体数量的限制,效果也是极为有限的。相对于传统的治疗方法而言,肿瘤靶向治疗的优势在于,能够利用特异性作用于肿瘤组织或器官的结合分子作为药物导向肿瘤的载体,改善了抗癌药物的传输效率,提高了药物对肿瘤组织的特异性,从而达到更为有效的治疗效果。目前已成为国际上学者们争相探讨和研究的热点,为肝癌的治疗带来了希望。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种抗癌活性高、抗癌作用广泛的两亲性蒽环类抗生素,也是目前使用最多的化疗药物之一。阿霉素主要作用于细胞核,可抑制RNA和DNA的合成,尤其体现在对RNA的抑制作用上,属细胞周期性非特异性药物,对处于各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但是这种广谱的抗肿瘤药物,对机体可产生广泛的生物化学效应,具有强烈的细胞毒性作用,尤其是引起严重的心脏毒性,抑制骨髓造血功能,严重时可出现心力衰竭。这些毒副作用使得阿霉素在临床上的应用受到了很大的限制。本实验室前期采用噬菌体展示肽库技术,筛选到在体内外都能够与肝癌组织或细胞高亲和力结合的特异性短肽,命名为A54,该短肽由12个氨基酸组成,序列为AGKGTPSLETTP。由于A54分子量小,进入体内后相应的免疫原性较小,穿透性好,因此与传统以单克隆抗体为导向载体的肿瘤靶向药物相比,能够更有效地富集在肿瘤组织部位。本论文拟采用化学合成的方法,将A54与阿霉素进行偶联,中间加上一段可被细胞内组织蛋白酶(Cathepsin B)特异性降解的小肽段GFLG,构建了肝癌特异性靶向治疗药物A54-GFLG-DOX。该靶向药物可以在A54的导向下,将DOX特异性地富集到肿瘤组织部位,并在其进入肿瘤细胞后,在溶酶体内组织蛋白酶的降解下,可以将DOX与A54断开,使DOX更好地进入细胞核部位,从而达到更为有效的杀伤肿瘤细胞的效果。本论文主要分为以下三个部分：一、肝癌特异性靶向药物A54-GFLG-DOX的化学偶联利用化学合成的方法,先得到12个氨基酸的短肽A54与4个氨基酸的GFLG的合成产物AGKGTPSLETTP-GFLG,再将该产物与DOX进行化学键的偶联,得到AGKGTPSLETTP-GFLG-DOX,简称为A54-GFLG-DOX。同时合成另外两种产物作为对照,一种是A54-DOX,该化合物没有加入连接肽GFLG,而是将A54直接与DOX进行化学偶联；另一种是A54M-DOX,该化合物是将A54中间位点的脯氨酸(P)、丝氨酸(S),分别突变成为丙氨酸(A)、丙氨酸(A)。最后将上述几种合成产物,用高相液相色谱(HPLC)以及质谱(MS)法进行鉴定,纯度均高于95%,成功得到了几种合成产物。二、肝癌特异性靶向药物A54-GFLG-DOX的体外活性鉴定1.药物体外细胞毒性检测采用MTS法,以DOX、A54-DOX、A54M-DOX为对照,检测A54-GFLG-DOX对肝癌细胞株BEL-7402和SMMC-7721的毒性作用。结果表明A54-GFLG-DOX保留了DOX的细胞毒性作用,并且呈现良好的剂量依赖关系。2.药物体外结合活性检测利用荧光显微镜观察药物与肝癌细胞结合情况,以及药物进入细胞核的量,分别将上述几种药物与肝癌细胞株BEL-7402及SMMC-7721进行孵育,于30min及12h后进行荧光显微镜拍照,初步鉴定合成药物的生物学活性。结果发现,作用30min后,各药物在细胞核部位的聚集情况没有显著性的差异；随着时间的推移,药物作用于细胞24h后,A54-GFLG-DOX在细胞核部位的聚集情况最为明显。三、肝癌特异性靶向药物A54-GFLG-DOX的体内活性鉴定及生理指标检测1.靶向药物的体内活性鉴定以肝癌细胞株BEL-7402注入裸鼠皮下,建立肝癌荷瘤裸鼠动物模型,以DOX、A54-DOX、A54M-DOX及PBS作为对照,以A54-GFLG-DOX作为实验组,通过尾静脉分别注射上述各药物,通过对肿瘤体积及裸鼠体重的监测来评价该抗肿瘤药物的体内生物学活性。结果显示,相对于A54-DOX、A54M-DOX组,A54-GFLG-DOX保留了DOX的抗肿瘤活性,并且相对于DOX,该靶向药物A54-GFLG-DOX大大的降低了对荷瘤裸鼠的毒副作用。2.药物对裸鼠血液中各生化指标的影响经过一段时间的药物注射后,取裸鼠全血,全自动生化分析仪对全血中白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)以及血小板计数(PLT)进行检测。另外取裸鼠血.清,对血清中谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(AKP)、尿素氮(BUN)以及肌酐(CREA)等生化指标进行测定。通过这些生化指标的变化,来评价A54-GFLG-DOX的抗肿瘤活性。四、肝癌特异性靶向药物A54-GFLG-DOX的体内分布情况在注射上述各药物2h后,取裸鼠心、肝、脾、肺、肾、瘤,用匀浆器研磨后除蛋白,离心收集上清,利用高相液相色谱(HPLC)技术,检测各上清中药物的残余量。从而进一步验证,A54-GFLG-DOX对肿瘤组织靶向作用。结果显示,相对于游离DOX和A54M-DOX, A54-DOX及A54-GFLG-DOX在肿瘤部位都有显著性的富集,说明A54在偶联上DOX之后,对于肿瘤部位依然有良好的靶向能力；而相对于A54-DOX来说,A54-GFLG-DOX在肿瘤部位的富集更为明显。从上面的结果,我们得到以下结论：1、成功构建了肝癌特异性靶向药物A54-GFLG-DOX;2、通过细胞毒性实验,确定了上述成功构建的肝癌靶向药物A54-GFLG-DOX对肝癌细胞株BEL-7402及SMMC-7721有明显的杀伤活性;通过荧光显微镜观察,确定了A54-GFLG-DOX对肝癌细胞具有靶向作用；3、体内抑瘤实验结果表明,A54-GFLG-DOX对荷瘤裸鼠的肿瘤具有明显的抑制作用,裸鼠体重变化显示,该药物对裸鼠的毒副作用明显比DOX的小；4、用HPLC检测裸鼠各组织中残余的药物含量,发现A54-GFLG-DOX在肿瘤组织中含量最高,A54-DOX其次,说明A54对肿瘤细胞的特异性结合非常稳定,具有很好的应用前景。