目的：　　 胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，呈侵袭性生长，在肿瘤和正常脑组织之间没有明显的界限，手术不能彻底根除，放、化疗效果差，残存的肿瘤细胞往往是复发的根源，导致病死率居高不下。目前关于胶质瘤发病机制的研究已经达到分子水平，靶向基因治疗成为研究热点，而寻找靶向性基因治疗所需要的能定向迁移、直达肿瘤局部释放活性因子的运送载体具有重要的意义。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是指一群来源于骨髓的具有多种分化潜能的成体干细胞。其取材方法简单，外源基因表达稳定，具有良好的可塑性，自体移植避免了免疫排斥和伦理争议。研究表明BMSCs可以在多种细胞因子及趋化因子的作用下对颅内缺血、炎症和肿瘤病灶做定向迁移。因此BMSCs可作为基因治疗较为理想的靶细胞。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)能够调节细胞增殖、分化和迁移，各种恶性程度的胶质瘤均可发现PDGF家族因子的过度表达。其作用通过PDGF与PDGF受体(PDGF receptor，PDGFR)结合进而激活一系列的细胞内信号转导通路来发挥多种的细胞效应。PDGF的纯合二聚体PDGFBB是强有丝分裂原，已知多种颅外肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞复合表达PDGFBB及其受体密切相关。细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子。ICAM-1作为BMSCs鉴定时使用的重要表面标志之一，在BMSCs表面表达。p38MAPK是一条重要的细胞内信号转导通路，研究p38MAPK与PDGFBB诱导的BMSCs迁移以及BMSCs表达粘附因子ICAM-1之间的关系可为研究BMSCs向胶质瘤趋化迁移的机制提供理论依据。　　 本实验首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，利用Transwell体外趋化迁移模型证实大鼠BMSCs具有向C6胶质瘤细胞趋化迁移的能力。然后利用大鼠C6胶质瘤模型观察经颈内动脉移植大鼠BMSCs后其向C6胶质瘤趋化迁移的能力，设立对照分析小剂量缓激肽选择性开放血脑肿瘤屏障是否增加BMSCs的趋化迁移效率。分析PDGFBB在BMSCs向C6胶质瘤定向迁移过程中的作用，研究PDGFBB对BMSCs表达ICAM-1的影响，研究p38MAPK信号通路与PDGFBB诱导的BMSCs迁移和粘附分子ICAM-1表达之间的关系，初步阐明PDGFBB在BMSCs向胶质瘤定向迁移过程中的作用。本研究所取得的结果将进一步为以BMSCs作为运送载体的胶质瘤靶向基因治疗提供实验及理论依据，并为探索更适于临床应用的移植方法提供新思路。　　 材料和方法：　　 一、大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向C6胶质瘤的体外趋化迁移　　 1、实验材料　　 (1)动物：4-6周龄健康雌性Wistar大鼠，体重60-80g。　　 (2)主要试剂：Ficoll-paque离心液；L-DMDM培养基，胎牛血清；小鼠抗大鼠CD45多克隆抗体，兔抗大鼠CD34，CD44，CD54，CD105，GFAP，NSE多克隆抗体；SABC免疫组化试剂盒，DAB底物显色试剂盒；β-巯基乙醇，碘化丙啶。　　 (3)主要仪器：超净工作台；二氧化碳培养箱；倒置显微镜；离心机；流式细胞仪；Transwell小室。　　 2、实验方法　　 (1)大鼠BMSCs的分离培养：采用密度梯度离心法和贴壁培养法。　　 (2)免疫组化方法鉴定BMSCs表面标志。　　 (3)测定BMSCs的细胞周期，评估其向神经元样细胞分化的能力。　　 (4)利用Transwell评估BMSCs向C6胶质瘤细胞体外趋化迁移的能力。　　 二、经颈内动脉移植大鼠骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤趋化迁移　　 1、实验材料　　 (1)动物：健康雌性Wistar大鼠，体重60-80g，用于BMSCs的分离培养；健康雌性Wistar大鼠，体重200-250g，用于建立大鼠颅内C6胶质瘤模型。　　 (2)主要试剂：BrdU，小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体；SABC试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒；缓激肽。　　 (3)主要仪器：超净工作台；二氧化碳培养箱；离心机；立体定向头架；微量注射泵；切片机；倒置显微镜。　　 2、实验方法　　 (1)分离培养大鼠BMSCs。　　 (2)立体定向技术建立大鼠颅内C6胶质瘤模型。　　 (3)BrdU体外标记BMSCs。　　 (4)经肿瘤同侧颈内动脉植入BMSCs，免疫组化方法观察BMSCs颅内的分布。小剂量缓激肽选择性开放血脑肿瘤屏障后经肿瘤同侧颈内动脉植入BMSCs并设置对照，检测两组差别。　　 三、血小板源性生长因子BB对大鼠骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤的趋化作用及机制　　 1、实验材料　　 (1)实验动物：健康雌性Wistar大鼠，体重60-80g。　　 (2)主要试剂：兔抗大鼠PDGFBB、PDGFR多克隆抗体；小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体；重组大鼠PDGFBB，大鼠PDGFBB中和型抗体；p38MAPK信号通路抑制剂SB203580，二甲基亚砜；Trizol；RNA PCR kit。　　 (3)主要仪器：超净工作台；二氧化碳培养箱；倒置显微镜；离心机；Transwell；紫外线可见光分光光度计；PCR仪；电泳仪；凝胶成像系统；荧光显微镜。　　 2、实验方法　　 (1)应用RT-PCR和免疫组化的方法检测C6胶质瘤细胞对PDGFBB的表达以及BMSCs对PDGFBB受体PDGFR的表达。　　 (2)利用Transwell体外模型评价PDGFBB对BMSCs向C6胶质瘤细胞趋化迁移的影响以及对BMSCs粘附能力的影响。　　 (3)应用RT-PCR和免疫荧光方法检测PDGFBB对BMSCs表达ICAM-1的影响。　　 (4)应用RT-PCR和免疫荧光方法检测p38MAPK的抑制剂SB203580对PDGFBB诱导BMSCs发生定向迁移的影响以及对BMSCs表达ICAM-1的影响。　　 实验结果：　　 一、大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向C6胶质瘤的体外趋化迁移　　 1、密度梯度离心法和贴壁培养法均可培养BMSCs；免疫组化染色表明培养的BMSCs阳性表达CD44、CD54、CD105，而对CD34、CD45呈阴性表达；应用流式细胞仪检测细胞周期，显示70％以上的细胞处于G0/G1期，仅有少数细胞处于S和G2/M期，此符合干细胞的特点；体外培养所获得的BMSCs经β-巯基乙醇诱导后能够分化为神经元样细胞。　　 2、Transwell趋化迁移实验证实在体外C6细胞培养上清液可诱导BMSCs向其定向迁移。　　 二、经颈内动脉移植大鼠骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤趋化迁移　　 1、BrdU标记的BMSCs经肿瘤同侧颈内动脉灌注，可通过血脑肿瘤屏障向C6胶质瘤组织趋化迁移，并在荷瘤鼠脑内存活。　　 2、BMSCs移植后的脑内分布：C6胶质瘤组织内、肿瘤组织和正常脑组织交界均可见BMSCs分布，正常脑组织区域未见BMSCs分布。　　 3、小剂量缓激肽选择性开放血脑肿瘤屏障能够增加移植BMSCs向C6胶质瘤组织的迁移数量。　　 三、血小板源性生长因子BB对大鼠骨髓间充质干细胞向C6胶质瘤的趋化作用及机制　　 1、RT-PCR和免疫组化结果显示：C6胶质瘤细胞表达PDGFBB，大鼠BMSCs表达PDGFR。　　 2、Transwell体外趋化迁移实验结果显示：PDGFBB可以诱导BMSCs向C6胶质瘤组织定向迁移。应用PDGFBB的中和型抗体可使通过聚碳酸酯膜迁移的BMSCs数量减少。PDGFBB是诱导BMSCs迁移的细胞因子之一。　　 3、PDGFBB可以上调BMSCs对ICAM-1的表达，增强BMSCs的迁移和粘附能力。　　 4、应用SB203580阻断p38MAPK后，PDGFBB诱导的BMSCs迁移数量减少，PDGFBB上调BMSCs对ICAM-1表达的能力受到抑制。　　 结论：　　 1、密度梯度离心法和贴壁培养法所分离、培养的骨髓细胞，CD44、CD54、CD105呈阳性表达，可以向神经元样细胞诱导分化，证实具有骨髓间充质干细胞的表型和功能特点。在体外C6细胞培养上清液具有诱导BMSCs向C6胶质瘤组织趋化迁移的作用。　　 2、经颈内动脉移植的BMSCs具有通过血脑肿瘤屏障向C6胶质瘤组织趋化迁移的能力，小剂量缓激肽选择性开放血脑肿瘤屏障能够提高BMSCs的移植效率。　　 3、PDGFBB是诱导BMSCs向C6胶质瘤趋化迁移的细胞因子之一，在一定范围内，其趋化能力与浓度成正比。PDGFBB可以上调BMSCs对ICAM-1的表达，增强BMSCs向C6细胞的迁移能力；p38MAPK是PDGFBB诱导BMSCs趋化迁移过程中重要的信号分子之一。