论文部分内容阅读
三角帆蚌(Hyriopsis cumingii),是我国重要的淡水育珠蚌种。本论文克隆了三角帆蚌中HcMSP130-rel-2和HcCRT两个基因。并通过组织表达,诱导表达及原核表达初步探索两个基因可能的生理功能。扩增出HcMSP130-rel-2基因的部分基因组DNA序列和5′调控区。通过直接测序法在两个三角帆蚌群体(白色珍珠群体与紫色珍珠群体)中筛选该基因的SNP(single nucleotide polymorphism)。主要研究结果如下:(1)三角帆蚌HcMSP130-rel-2,HcCRT基因cDNA克隆和结构分析HcMSP130-rel-2基因cDNA序列全长为2343bp,包括572bp5UTR,475bp3UTR,开放阅读框(ORF)长1293bp,编码430个氨基酸。该基因编码的蛋白与长牡蛎中MSP130的相似度最高为45%。系统树显示,HcMSP130-rel-2与长牡蛎中MSP130家族蛋白聚集在一支。本次获得的三角帆蚌HcCRT的cDNA长1437bp,开放阅读框为591bp,编码196个氨基酸,231bp的5UTR,下游616bp的3UTR。与已知物种的CRT家族具有极高保守性,其中与斑马鱼的相似度最高为77%。 HcCRT具有2个保守的钙网蛋白家族标签序列KHEQNIDCGGGYLKVF和IMFGPDICG。(2)三角帆蚌HcMSP130-rel-2,HcCRT基因组织表达及原核表达HcMSP130-rel-2基因在外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达,其中在三角帆蚌外套膜中的表达量最高,在肝脏中表达较高,在血液、肠等组织中表达量较少。HcMSP130-rel-2基因表达存在显著差异。对健康地成年的三角帆蚌破壳处理,在处理后的2h、6h、12h、24h、2d、4d、7d、15d和30d等9个时间点检测HcMSP130-rel-2在外套膜和闭壳肌中的表达情况。在外套膜中HcMSP130-rel-2的表达量呈现先升高后降低的趋势,在破壳处理后的7d时表达量达到最高值,其后降低。而在闭壳肌中则无明显的变化。HcCRT基因在三角帆蚌外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达。其中外套膜中的HcCRT表达丰度最高,血液和闭壳肌次之,鳃中表达水平相对较低,而在肝脏、肾、肠和闭壳肌表达量极低,几乎不表达。HcCRT基因mRNA在组织表达中存在显著差异。在37℃,利用1.2mmol/L的IPTG诱导HcMSP130-rel-2基因的重组质粒在表达菌株中表达,通过SDS-PAGE进行检测显示,蛋白以包涵体的形式存在,表达量随诱导时间的延长而增加,在诱导后的7h表达量最大。(3)三角帆蚌HcMSP130-rel-2基因组序列、5′调控区及SNP分析扩增出HcMSP130-rel-2基因的部分基因组DNA序列和5′调控区。其中5′调控区含,如HSF、CF-1、Cap、GATA2以及HNF-3b等多个转录调控元件。以三角帆蚌白色群体和紫色群体为研究对象,通过直接测序法筛选SNPs位点。在MSP130-rel-2基因中筛选出41个SNP位点,其中P-278A-T位点、P-337G-A位点位点的基因型频率和等位基因频率在2个群体中均存在显著性差异(P<0.05),P-140T-G位点、P-158T-C位点等位基因频率在2个群体中存在显著性差异(P<0.05),P-258A-G位点基因型频率在2个群体中存在显著性差异(P<0.05)。P-303A-G位点G/G基因型、P-496C-T位点T/T基因型特异性存在于白色三角帆蚌群体中,P-170G-。C位点T/T基因型、P-491A/G/T位点A/T基因型、I-3092C-T位点T/T基因型特异性存在于紫色三角帆蚌群体中。