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牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛的一种热性传染病,呈世界性分布,常造成牛只持续性感染和免疫抑制,临床以腹泻,消化道黏膜发炎、糜烂和坏死及并发呼吸道感染为主要特征,该病严重影响牛的生产性能,给养牛业造成了巨大的经济损失。因此,深入研究BVDV的感染与致病机制对该病的防治具有重要意义。转录组与蛋白质组整合分析是一种全面解析生物基因表达调控机制的方法。可实现m RNA和蛋白质的互补与整合,进而对生物体特定状态下的应激机理进行全方位分析。为进一步认知BVDV感染的过程,本研究利用RNA-seq技术和i TRAQ技术对感染BVDV后48h(早期感染)的MDBK细胞样本进行了转录组测序和蛋白质学分析,为挖掘在BVDV感染早期与宿主相互作用的关键细胞因子及其潜在调控机制提供了基础数据。在此基础上,通过转录组与蛋白组学数据整合分析,筛选并鉴定出宿主蛋白DHCR24在BVDV感染过程中对病毒复制具有促进作用。具体研究内容如下:第一,利用RNA-seq技术对BVDV感染MDBK细胞样本进行转录组测序,测序数据与NCBInr/Swiss Prot/Uniprot/IPI参考数据库比对,通过基因丰度量化筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能注释及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。结果显示,以|log2FC|>1.5且p-value<0.05为判定标准,共筛选出168个显著差异表达的m RNAs(其中43个显著上调表达的m RNAs和125个显著下调表达的m RNAs),如NGF、BCL2A1、BIRC3、m TOR、DHCR24等参与细胞周期、凋亡、自噬及脂代谢等相关基因;将差异表达的m RNAs进行GO功能注释以及KEGG通路富集分析,结果显示,显著差异表达的m RNAs主要富集于TNF信号通路、NLRs信号通路、NF-κB信号通路、TLRs信号通路、MAPK信号通路、脂代谢信号通路等。第二,利用i TRAQ技术对BVDV感染MDBK细胞样本进行蛋白质组学测序分析,筛选显著差异表达的蛋白,并对差异表达蛋白进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。结果显示,以|log2FC|>1.5且p-value<0.05为判定标准,共筛选出72个显著差异表达的蛋白,其中16个显著上调表达的蛋白和56个显著下调表达的蛋白;通过GO功能注释以及KEGG通路富集分析显示,差异表达的蛋白显著富集于内质网蛋白质加工、类固醇合成、内吞、代谢等通路;通过转录组学与蛋白质组学数据整合分析,筛选出m RNA转录水平与对应的蛋白表达水平模式相一致的宿主蛋白DHCR24,已有资料显示,DHCR24具有抗细胞凋亡作用及调控胆固醇合成等多种生物学活性,预示宿主蛋白DHCR24在BVDV感染初期的病毒复制过程中发挥着重要作用。第三,探究了宿主蛋白DHCR24在BVDV感染中促进病毒复制的作用及其机制。分别采用RT-q PCR和Western blot方法对BVDV感染MDBK细胞后宿主蛋白DHCR24的m RNA转录水平及蛋白表达水平与RNA-seq结果和i TRAQ结果进行符合验证,结果显示,在BVDV感染早期,宿主DHCR24的m RNA转录水平与对应的蛋白水平均表现为上调表达,且与未感染细胞对照组相比差异显著;采用过表达DHCR24方法分析其对BVDV复制的影响,结果显示,过表达DHCR24可显著促进BVDV复制,敲低DHCR24基因表达水平后,细胞内胆固醇水平也随之降低,同时BVDV的复制能力受到抑制,表明BVDV感染可诱导宿主蛋白DHCR24调控胆固醇的合成以促进病毒复制;在敲低DHCR24基因表达水平的细胞的培养体系中添加胆固醇,结果显示BVDV的复制能力明显恢复,表明胆固醇在BVDV复制过程中具有重要作用;利用DHCR24抑制剂U18666A处理细胞后感染BVDV,结果显示,BVDV的复制能力降低,且存在剂量依赖性,添加胆固醇后,BVDV复制能力显著恢复,研究结果进一步表明,宿主蛋白DHCR24调控胆固醇合成的通路对BVDV复制具有重要作用。综上,本研究利用RNA-seq技术和i TRAQ技术获得了BVDV感染早期宿主m RNA表达谱和蛋白表达谱数据,筛选出了显著差异表达的宿主m RNAs和宿主蛋白,为进一步认知BVDV感染早期与宿主的互作机制提供了基础数据。同时,本研究阐明了BVDV调控宿主蛋白DHCR24表达以促进自身复制的作用及机制,为进一步揭示脂代谢在BVDV入侵与复制中的作用机制奠定了基础。