背景：近十年来造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）研究取得了长足的进展，然而，对干细胞行为的许多基本问题的理解仍存在很多争议。造成这种状况的一个重要原因是以往研究大多针对HSC这个不均一的群体，且多为端点分析；而非针对单个造血干细胞的连续性研究。仅通过某一端点的结果来回顾性推测中间过程中发生的情形是很困难的，实现对细胞及其子代的行为和归宿的连续观察成为干细胞生物学越来越迫切的需要。实时成像技术是一个有力的工具，可更清晰直观的研究正常或经基因调控的HSC特性。干细胞具备自我更新和多系分化的基本特性，目前主要通过体外功能实验来间接反映造血干细胞的特性。因其模拟体内生理环境的特点，长期培养（Longterm culture，LTC）比其它体外培养方法更能反映和维持HSC特性。它部分的重现了体内造血干细胞壁龛的功能，为造血干细胞提供了一个特殊的微环境，通过细胞之间的相互作用影响和调节干细胞数量和功能。在体系中存在两种形态：鹅卵石样区域（cobblestone area，CA）和基质细胞上集落（colony on stroma，COS），它们的动态变化在一定程度上重演了体内造血重建的过程。CA是造血细胞在基质细胞下方形成的区域，在显微镜下呈鹅卵石样，可长时间存在（大于4周），在所有体外实验方法中是一个最能反映HSC自我更新的指标。CA周围常伴随着集落形成（COS），位于基质细胞上方，通常认为是CA细胞分化的后代，但至今并无直接的证据表明COS与CA的关系。鹅卵石样区域形成细胞（cobblestone area forming cell，CAFC）和长期培养启动细胞（long-term culture initiating cells，LTC-IC）同属长期培养中的两种细胞类型，前者属形态学的概念，后者属功能性概念，两者的范畴有极大的重叠，比集落形成测试中的高增殖潜能集落形成细胞（high proliferative potential colony forming cell，HPP-CFC）和混合集落（colony forming unit-granulocyte，eythrocyte，macrophage，megakaryocyte，CFU-GEMM）更原始，大致相当于体内功能实验的长期重建造血细胞。和其它体外培养方法一样，经典的长期培养也是端点研究，只能对数个时间点的结果进行观察，而非连续性观察，因此尚有许多问题悬而未决。在长达5周以上的培养过程中，“黑箱子”里面发生了什么样的改变导致上述的观察结果?COS是否由CA衍生而来?HSC与HPC形成CA有何本质区别?HSC的持续CA形成是否与早期行为特性有关?早期CA形成过程是否存在预示HSC特性的指标?HSC细胞如何与基质细胞相互作用?为了连贯而细致的记录细胞行为，必须借助新的观察工具——实时成像技术。然而，活细胞实时成像技术用于分析造血干细胞在长期培养体系中的特征尚存在诸多挑战。目的：在模拟体内生理环境的体外长期培养体系中，实时监测、比较小鼠造血干细胞和造血祖细胞（Hematopoietic progenitor cell，HPC）的生物学行为、与基质细胞相互作用、鹅卵石样区域形成的规律。通过建立适合于LTC的实时成像和分析方法，为体外更直观的研究HSC的行为特性和评价干细胞壁龛建立新的平台。方法：1．纯化和验证小鼠造血干祖细胞群。C57BL／6小鼠骨髓细胞进行多色标记，流式细胞术分选出CD34^-LKS、CD34⁺LKS和LKS^-细胞群，体内外功能检测比较三组细胞亚群自我更新和多系分化的能力。单个细胞在体外液体培养10-14天，给予支持向髓系分化的细胞因子，增殖分化的集落以显微镜检查，明确集落所含的终末分化细胞类型（粒系、巨噬系、红系和巨核系，nmEM），从而回顾性分析初始细胞的多系分化潜能。在致死剂量照射的受体小鼠体内进行移植并比较竞争性造血重建能力：流式细胞仪分离出CD45.1小鼠CD34^-LKS和CD34⁺LKS细胞群，分别以50个CD34^-LKS细胞或300个CD34⁺LKS细胞，和来自CD45.1／CD45.2小鼠的1×10⁵个骨髓细胞一起注入CD45.2受体小鼠体内，移植后于3周、12周和5月采集外周血，以流式细胞仪检测供体细胞植入率。2．比较三种不同来源的壁龛细胞。以MC3T3-E1亚克隆4分化的成骨细胞（OB）、来源于小鼠胎肝的AFT024细胞系和小鼠骨髓来源的原代基质细胞（primary stroma，PS）为研究对象，比较对LTC 5周小鼠骨髓鹅卵石样区域形成细胞频率的影响。C57BL／6小鼠骨髓细胞重悬于加有10^-6 M氢化可的松的造血干细胞长期液体培养基MyeloCult^TM M5300，以有限稀释法接种在饲养层上进行共培养，33℃条件下长期培养5周，CAFC频率根据泊松分布统计由线性回归分析每孔接种密度对应于阴性孔比例的对数决定。3．比较纯化的小鼠造血干祖细胞在LTC中的CA和COS形成特点。在上述实验结果的基础上，以PS为饲养层细胞，应用传统的长期培养方法，将小鼠骨髓细胞中分离出来的CD34^-LKS、CD34⁺LKS和LKS^-细胞群长期培养5周以上，比较每周的CA和COS形成率，流式细胞术测定造血干祖细胞在骨髓中的含量，比较三组细胞群对每周CA形成的实际作用。4．建立长期（5周以上）实时监测和分析LTC中的HSC行为的方法。应用实时成像技术连续监测绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠的纯化HSC和HPC在原代骨髓基质细胞层上长期培养的细胞分裂／休眠、增殖／死亡、分化／自我更新、移行、CA形成的动态变化等行为和归宿。随访多个目标细胞，进行短间歇明视野拍摄，自动记忆物理位置，每间隔10分钟随访。结合每100分钟一次的荧光视野拍摄，提高细胞跟踪的精确性，同时降低对细胞的光毒性，使5周以上的长期拍摄成为可能。使用多个相邻视野组合成的拼图（mosaic）以跟踪跨视野移动的细胞。对每一视野进行z轴不同位置自动多层扫描，使处在不同层面的CA和COS均能清晰聚焦。开发适合长期培养图像递呈和分析的软件，建立分析HSC特性的参数。结果：1．nmEM四系都存在提示初始细胞的状态较为原始，在体外液体培养2周后几无LKS^-细胞能同时向四系分化，约9％的CD34⁺LKS单个细胞在体外增殖分化成nmEM四系，而CD34^-LKS亚群中有相当一部分（＞30％）具有多系分化特性。卡方检验比较三种亚群形成nmEM的细胞百分率（p＜0.001，n=180）。50个CD34^-LKS细胞在移植后3、12、21周的平均植入率分别为17.8％、18.8％、15.2％；300个CD34⁺LKS细胞在移植后3、12、21周的平均植入率分别为9.6％、1.3％、0.8％。2．在原代骨髓基质细胞上长期培养5周，每12×10⁴骨髓细胞有一个CAFC。而与AFT024共培养，则每27×10⁴个骨髓细胞有一个CAFC。MC3T3-E1亚克隆4分化的成骨细胞系的支持能力最差，每2×10⁶个骨髓细胞有一个CAFC。原代骨髓基质细胞上的CAFC得率为AFT024的2.2倍，成骨细胞的17倍。3．三组细胞群的CA和COS随时间的动态变化呈不同跨度的单峰曲线。CD34^-LKS细胞在第二周形成CA和COS，并在第三、四周达到高峰，可一直持续到第六周。CD34⁺LKS细胞则在第一周就已形成CA和COS，维持至第三至四周下降。LKS^-细胞在第一周同时形成CA和COS，之后减少，第二周起就几乎不能检测到。CA和COS动态变化有良好的相关性。从每周的构成比来看，早期CA（1～2周）反映的是LKS^-细胞的活动，中期（3～4周）CA主要是CD34⁺LKS的贡献。第四周起，CD34^-LKS的权重逐渐增加，培养晚期（5～6周）几乎所有CA均来自CD34^-LKS这个亚群。4．（1）通过对长期培养的进一步实时监测，直接观察到CA细胞逐渐移行至基质细胞上方成为COS细胞的过程。CAFC与形成的CA存在一对一和一对多的关系。HSC形成CA在时间和空间上都表现出多峰（multiple waves）的形式，而不是持续时间较长的单峰曲线，比上述非连续观察更精确的体现出动态变化的规律。HPC形成早期CA所需时间分别为2.5至3.2天，比HSC更早（提前24小时以上）（p＜0.05）。（2）三组细胞群均存在潜行、蛰伏于体外壁龛的行为，长期造血重建的干细胞（long term haematopoietic stem cell，LT-HSC）在第一次分裂前总共蛰伏于基质下的时间最长，约27小时，短期造血重建的干细胞（short termhaematopoietic stem cell，ST-HSC）其次为19小时，HPC最短约13小时。差别均具有统计学意义（p＜0.05）。（3）第一代LT-HSC进入分裂周期所需时间最长，约37.8小时，ST-HSC需31.9小时，HPC最短，平均需24小时，三组亚群之间有显著差异。但从第二代起，细胞进入下一次分裂的时间同步化，亚群之间的差别不大。（4）对CAFC姐妹细胞分裂时间差异的分析提示第二代与第三代姐妹细胞在分裂时间上具有同步性，LT-HSC并未比ST-HSC和HPC显示更多姐妹细胞的异质性（姐妹细胞差异值的标准差分别为0.76小时、0.65小时和0.75小时）。结论：1．CD34^-LKS细胞群为LT-HSC的免疫表型，CD34⁺LKS细胞群为ST-HSC的免疫表型，LKS^-亚群为HPC的免疫表型。2．比较AFT024、成骨细胞和原代骨髓基质细胞这三种不同来源的壁龛细胞，其中原代骨髓基质细胞支持骨髓单个核细胞CAFC能力最强，故选为本研究长期培养的饲养层细胞。3．LT-HSC、ST-HSC和HPC细胞在长期培养中均能形成CA和COS单峰动态变化，但三组亚群出现集落、持续和高峰时间各不相同。COS伴随CA出现，与CA有相似的时间动力曲线，两者之间存在相关性。4．本研究将实时成像系统应用在经典的LTC中，建立了对小鼠HSC进行长期实时监测的可行的方法以及评价HSC行为的一系列参数，为进一步直观的研究干细胞行为特性和干细胞壁龛的相互作用提供了新的平台。（1）长期实时成像使单个HSC细胞发展为一个大集落的过程可视化，为CA衍生为COS来源提供了直接证据。（2）HSC的CA形成在时间和空间上都表现为多峰。（3）与ST-HSCs和HPCs细胞群相比，LT-HSC细胞群倾向于和壁龛有更长时间的接触，在第一次分裂之前的休眠期更长，但在以后的细胞分裂中未见明显的休眠期和非同步性姐妹细胞分裂时间。LT-HSC的CA形成时间也明显延迟且持续更久。