稻瘟病抗病相关基因挖掘及OsRLK3抗病遗传机制研究

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:laozhoudehua
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水稻稻瘟病由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的无性世代引起,是水稻(Oryza sativa L.)最严重的病害之一,对水稻的产量与品质均产生重要的影响。目前,虽然已经鉴定出70多个水稻抗稻瘟病防御调控因子,但对水稻稻瘟病菌抗性的机制,如转录重编程、免疫信号通路和网络,仍然知之甚少。为了挖掘水稻抗稻瘟病防御调控因子并解析其分子机制,本论文进行了水稻与稻瘟病菌互作的转录组分析,揭示了水稻调控稻瘟病菌抗性的调控网络,鉴定了一组参与水稻免疫反应核心基因集。在此基础上,选择5个相关基因进行了功能验证,并对其中1个受体类激酶(receptor like kinases,RLKs)的作用机制进行了深入解析。因此,本研究将推动对水稻免疫系统的认知,为水稻抗病育种提供理论支持和基因资源。具体研究结果如下:1)在本论文研究中,通过对感病品种日本晴(Nipponbare,Nip)和抗病品种恢1586两个粳稻品种在稻瘟病菌侵染48 h内进行转录组分析与研究,获得了一个高质量、系统的转录组数据集。研究表明,快速、高幅度的转录重编程对水稻防御稻瘟病菌尤为重要,抗、感两个品种的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)中核糖体和蛋白质翻译相关基因在12 h水平显著富集,表明蛋白质翻译机制在水稻免疫激活过程中受到调控。此外,我们还鉴定了一组参与水稻对生物和非生物胁迫反应的321个核心基因。2)为了进一步验证转录组测序的准确性与可靠性,我们挑选了4个基因Os MT1a,Os MT1b,Perox4及Os SAMS1,并对它们在稻瘟病抗性中的功能进行了分析。结果发现,核心基因中Os MT1a和Os MT1b正调控水稻稻瘟病抗性,Perox4负调控水稻稻瘟病抗性。此外,非核心基因Os SAMS1的表达水平受稻瘟病菌诱导后明显提高。进一步研究表明,ossams1突变体对稻瘟病菌抗性显著降低,且体内病程相关基因的表达明显降低,乙烯合成相关基因的表达受到明显抑制,表明Os SAMS1参与了水稻的免疫反应,且正调控水稻稻瘟病的抗性。3)为了进一步解析稻瘟病抗性过程中的遗传机制,我们对核心基因中一个编码受体类激酶的基因OsRLK3进行了深入研究。OsRLK3受稻瘟病菌显著诱导表达,并参与调控水稻的免疫反应。接种稻瘟病菌后,osrlk3突变体与野生型相比表现更加感病,过量表达OsRLK3,与野生型相比,表现更加抗病。osrlk3突变体抑制防御相关基因的表达和过氧化氢的积累,但不影响株高、穗长和结实率等主要农艺性状。osrlk3突变体还对细菌(白叶枯病菌)表现更加感病。以上结果表明,OsRLK3是水稻抗性反应的正调控因子,且在水稻防御反应中具有广谱的作用。激酶活性分析表明,受体类激酶OsRLK3具有激酶活性。4)为了深入解析OsRLK3在水稻免疫中的功能,我们利用免疫共沉淀和质谱联用(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS)的方法寻找与OsRLK3互作的免疫相关蛋白。结果共鉴定了374个差异蛋白,其中LOC_Os03g12250为受体类激酶蛋白,为拟南芥中RLK902在水稻中同源蛋白之一,我们实验室将其命名为RLK902-2。为了进一步验证OsRLK3与RLK902-2互作关系,我们利用荧光素酶互补实验(split-luciferase complementation,LUC)、双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)和免疫共沉淀的方法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)证明了OsRLK3与RLK902-2之间存在互作。为了进一步确定OsRLK3与RLK902-2之间的遗传关系,我们在osrlk3突变体背景下敲除RLK902-2基因,稻瘟病菌接菌实验表明,osrlk3 rlk902-2双突变体、osrlk3和rlk902-2单突变体与野生型相比,均表现更加感病,而osrlk3 rlk902-2双突变体与osrlk3相比,感病性没有明显的差异。因此,我们推测OsRLK3与作为共受体的受体类激酶RLK902-2可能在同一条信号通路中调控水稻的免疫反应。综上所述,本研究鉴定一组参与水稻免疫反应的核心基因,确定了Perox4、Os MT1a、Os MT1b、Os SAMS1和OsRLK3等5个基因在稻瘟病抗性中的功能,揭示了OsRLK3调控水稻稻瘟病抗性的遗传机制,为稻瘟病抗性遗传机制研究提供有价值的候选基因,为稻瘟病抗病育种研究提供丰富的基因资源。
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