【摘 要】
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在高等植物中,细胞壁转化酶(cellwallinvertase,CWI)和液泡转化酶(vacuolarinvertase,VI)在调节糖信号和糖代谢中发挥重要的作用。它们能够调节植物的生长,糖库的交互和对环境胁迫的响应。CWI和VI的活性受转录水平和转录后水平不同层级的调控。C/VIF1(cellwall/vacuolarinhibitoroffructosidas
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在高等植物中,细胞壁转化酶(cellwallinvertase,CWI)和液泡转化酶(vacuolarinvertase,VI)在调节糖信号和糖代谢中发挥重要的作用。它们能够调节植物的生长,糖库的交互和对环境胁迫的响应。CWI和VI的活性受转录水平和转录后水平不同层级的调控。C/VIF1(cellwall/vacuolarinhibitoroffructosidase1)和C/VIF2是拟南芥转化酶的两个抑制子,对CWI和VI的活性有抑制作用,在转录后水平调控CWI和VI的活性。脱落酸(abscisicacid,ABA)参与调控植物生长和发育的多个方面,包括胚芽的发生、种子萌发和休眠、幼苗生长、生殖器官发育和果实成熟等等。同时,当植物面对非生物胁迫时,ABA通过激活/抑制响应基因的表达,调节植物的抗逆性。我们通过转录组测序,发现C/VIF1和C/VIF2受到ABA的调控。本论文系统地研究了C/VIF1和C/VIF2在调控拟南芥对ABA和盐胁迫响应中的作用。RT-PCR和qRT-PCR检测结果显示,C/VIF1和C/VIF2均在不同程度上受ABA诱导上调。为了研究C/VIF1和C/VIF2的功能,我们分别构建了35S:C/VIF1和35S:C/VIF2过表达转基因植株和功能缺失突变体。为了尽快获得两基因的功能缺失突变体,我们先是对CRISPR/Cas9基因编辑方法进行了优化。将含有能够促进早花的GmFT2a的表达框,插入pHEECRISPR/Cas9基因编辑载体中,从而获得了以早花作为辅助筛选标记的pHEE-FT载体。利用这一载体进行植物转化,在T1代我们可仅选取早花的植株,检测基因编辑情况。而在检查从T1代编辑植株获得的T2代时,我们仅需选取正常开花的植株,即无载体的非转基因突变体,检测基因编辑情况,获取纯合突变体。这样在通过对植株表型观察就能够获得非转基因突变体的同时,由于GmFT2a调控的早花缩短了植物的整个生长周期,也能够缩短突变体获得的总时长。利用已优化的pHEE-FT载体进行基因编辑,我们获得C/VIF1和C/VIF2基因的单突变体和双突变体。利用NBT染色的方法,证明所获得的不同编辑方式的突变体中转化酶的活性增加,说明C/VIF1和C/VIF2对转化酶的抑制活性减少/缺失。表型分析发现,单/双突变体的根长均比野生型长,荚果数目均比野生型多。ABA敏感性实验结果表明,35S:C/VIF1和35S:C/VIF2过表达植株对ABA敏感性增强。ABA处理后,其种子萌发速率均低于野生型。说明C/VIF1和C/VIF2均参与调控拟南芥对ABA的响应。同时,在盐胁迫的实验结果中我们发现,c/vif1-c2、35S:C/VIF2和c/vif1c/vif2对盐的耐受性减弱,但35S:C/VIF1和c/vif2没有明显变化。综上,C/VIF1和C/VIF2是ABA的响应基因,C/VIF1和C/VIF2参与调控拟南芥对ABA和盐胁迫的响应。
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