论文部分内容阅读
目的:观察HBV转基因小鼠急性肝损伤过程中肝脏PD-1、PD-L1、ICOS、ICOSL及血清中IL-4、IL-2、IFN-γ的动态变化情况,初步探讨HBV转基因小鼠在急性肝损伤的免疫变化机制。方法:选取20只健康雄性C57BL/6小鼠作为正常对照组(A组),20只健康雄性C57BL/6小鼠作为四氯化碳(CCL4)干预组(B组),20只雄性HBsAg表达阴性的转基因小鼠为转基因HBsAg阴性CCL4干预组(C组),20只雄性HBsAg表达阳性转基因小鼠为转基因HBsAg阳性CCL4干预组(D组),B、C、D组制作急性肝损伤模型,A组按0.5ml· kg-1腹腔注射橄榄油溶液,于0h、24h、48h、72h四个时间点取标本。B、C、D每组各留5只作为空白对照,均按0.5ml·kg-1腹腔注射橄榄油溶液,0h处死,其余15只各自随机分组,一次性给予0.5ml·kg-1腹腔注射10%CCL4橄榄油溶液,分别于24h、48h、72h每组随机挑选5只小鼠,采集标本,血清测定AST、ALT、ALP、TP、ALB、IL-4、IL-2、IFN-γ,同时取出肝脏,部分标本行HE染色及免疫组化,部分用于RT-qPCR方法鉴定肝脏中的PD-1、PD-L1、 ICOS、ICOSL的表达情况。结果:1、生化检测:24h,B组与A组比较,AST、ALT水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);B组和D组迅速达到高峰,与C组比较有统计学意义(P<0.01)。48h,C组达到峰值,但B组AST、ALT已经慢慢下降,与C组、D组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。2、病理学观察:24h,B组与A组比较已有明显病理改变。B、C、D组均出现广泛的肝细胞变性,坏死轻微,肝小叶内可有散在的点状坏死,以胞浆疏松化和气球样变最为普遍;48h,C组病变最严重,出现弥漫性的大片坏死;72h, B、C、D组均有片状坏死及大片的肝细胞胞浆疏松化及脂肪空泡,小叶内及汇管区有大量淋巴细胞和巨噬细胞为主的炎细胞浸润,但C组的病变最严重。3、免疫组化:B组48h ICOS、ICOSL高表达,72h又表达了PD-L1; C组PD-1从24h至72h一直持续高表达,ICOS24h高表达,PD-L148h以后持续高表达;D组72hPD-1、ICOSL高表达。4、RT-qPCR:B组ICOS24h至72h一直高表达,PD-124h高表达;C组PD-1从24h至72h一直持续高表达,ICOS24h高表达,ICOSL48h高表达:D组72h ICOSL高表达。5、CBA:B、C、D组动物IL-2在0h D组高表达,24h C组升高显著,48h B、C组继续升高,而D组迅速下降,与B、C组比较有统计学意义(P<0.01)。B组IL-248h达到峰值,72h迅速下降。C组24h开始升高,48h达到峰值,72h迅速下降。B、C、D组动物IFN-γ在0h B组高表达,24h B、D组表达升高,但C组仍保持高表达,48h B、C组继续升高,而D组迅速下降,72h B、C组均降低,而D组升高与B、C组比较有统计学意义(P<0.01)。B组IFN-γ表达在24h开始升高,48h达到峰值,72h迅速下降。C组Oh、24h、48h始终高表达,72h迅速下降。D组48h降低,与Oh、24h、72h比较有统计学意义(P<0.01)。B、C、D组动物IL-4在Oh B组与C、D组有统计学意义,24h三组IL-4表达均升高,48h B、C组继续升高,而D组迅速下降,72h B、C组迅速降低,而D组升高与B、C组比较有统计学意义(P<0.01)。在B组、C组24hIL-4表达开始升高,48h达到峰值,72h迅速下降。D组24h IL-4表达开始升高,48h降到最低,72h迅速上升。结论:HBV转基因小鼠24h即可出现急性肝损伤,尤其是HBsAg表达阴性的转基因小鼠损伤比阳性小鼠更严重。正常小鼠和转基因HBsAg阴性小鼠受到刺激PD-1、PD-L1、ICOS、ICOSL及血清中IL-4、IL-2、IFN-y均升高,发生强烈的免疫反应,而转基因HBsAg阳性小鼠组免疫分子一直表达较低,其可能原因是在受到长期HBsAg的刺激,使宿主发生了免疫耐受,因此在受到CCL4攻击后宿主的免疫应答水平下降,而使得宿主的病理损伤弱于转基因HBsAg阴性小鼠。