端粒酶复制延伸染色体端粒DNA,与人类衰老和肿瘤等重大医学问题有密切关系。端粒酶是一个具有逆转录酶活性的核糖核蛋白复合物,核心成分由一条单链端粒酶模板RNA(hTR)和一个端粒酶逆转录酶蛋白(hTERT)组成。hTERT能够以hTR为模板逆转录成端粒DNA序列并添加到染色体的末端,从而弥补细胞分裂过程中端粒序列的丢失,是端粒酶的催化亚基。hTERT是细胞端粒酶调控的限制性成分,其基因表达在正常体细胞中受多种抑癌途径的抑制,因此正常人体细胞通常检测不到端粒酶活性,其端粒DNA长度随细胞的连续分裂而发生渐进性缩短并最终引发细胞复制性衰老。癌变过程中癌基因活化或/和抑癌基因功能丧失能转录激活hTERT,造成肿瘤细胞中端粒酶重新活化,并由此赋予肿瘤细胞端粒稳定性和永生化生长能力。除了转录调控外,翻译后机制对hTERT的功能调控也有重要意义。最近发现一种调控hTERT正常核仁定位的机制在肿瘤细胞中普遍受到抑制,提示端粒酶的翻译后调控机制异常与肿瘤发生也有密切联系。此外,细胞中表达的端粒酶是如何被靶向输送到端粒末端发挥生物学功能的仍是一个未知问题。由于端粒酶已被确定为抗肿瘤治疗的新靶标,进一步阐明其调控中的未知问题对更好利用其医学价值有重要意义。PinX1是近年在人和酵母细胞中发现的一个能与端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白。人PinX1(PinX1,human PinX1)基因定位于染色体的8p23,是一处在多种肿瘤中发生高频杂合缺失的区域。PinX1蛋白全长328aa,N-端(aa1-142)和C-端(aa254-328)各含-个hTERT结合位点。高表达PinXl C-端片断能显著抑制细胞端粒酶活性,缩短端粒并抑制端粒酶阳性肿瘤细胞体内外生长。因此,PinX1被认为是细胞内在的端粒酶抑制因子和潜在的抑癌基因。但PinX1对细胞端粒酶/端粒的具体调控机制及在肿瘤中的意义仍不清楚。此外,PinX1还可以与人端粒DNA结合蛋白/TF1相互作用并直接定位于端粒,但这一相互作用的细胞生物学意义也不清楚。更值得注意的是,在酵母中敲除PinX1基因造成细胞端粒缩短和生长抑制,提示该基因在端粒酶/端粒调控中可能具有多重功能。由于端粒/端粒酶调控在肿瘤中的重要性,进一步阐明PinX1在其中的作用和机制有必要性。本论文就PinX1在人细胞端粒酶/端粒调控及肿瘤中可能存在的未知细胞生物学功能和相关的分子机制开展了以下内容的研究:一、PinX1在端粒酶核仁定位调控中的作用及生物学意义:细胞中表达的端粒酶存在一种受细胞周期、转化和DNA损伤调控的核仁定位行为,但介导端粒酶核仁定位的调控因子并不清楚。PinX1本身是一种核仁蛋白,因此其与hTERT直接相互作用有可能参与细胞中端粒酶核仁定位的调控。通过在肿瘤细胞中高表达PinX1,发现高表达PinX1能够促使肿瘤细胞中外源性和内源性表达的hTERT重新聚集在核仁结构中,并鉴定出PinX1介导hTERT核仁定位的功能结构域是位于其中部的氨基酸序列(aa 143-254),与其N.端和C-端的两个已知的hTERT结合位点无关。进一步证明一种在人肝癌细胞中发生高频突变(Ser254Cys,Cys265Tyr)的PinX1突变体丧失介导hTERT核仁定位的能力,但并不影响其已知的细胞端粒酶活性调控能力。本部分结果揭示出了PinX1存在一种介导端粒酶核仁定位的新功能,与其已知的端粒酶活性调控的生物学效应无关。同时提示了这种PinX1依赖的hTERT核仁定位途径在肿瘤细胞中的突变抑制,可能与肿瘤细胞中普遍出现的端粒酶核仁外分布的异常行为有联系。二、PinX1在人类细胞中的表达状态及其在肿瘤细胞中的生物学意义:PinX1在人细胞端粒酶调控中存在多重生物学效应促使我们进一步研究PinX1在细胞端粒酶/端粒调控的主要生理作用。利用制备获得的特异性抗PinX1抗体,首先检测了PinX1在正常和各种端粒酶阳性和阴性的人肿瘤细胞中的表达水平。证明PinX1蛋白在所有检测的人细胞系中均为组成型表达,与细胞的端粒酶状态和细胞癌变状态无关,且与正常细胞相比,PinX1蛋白表达水平在所有肿瘤细胞中并未受到抑制,说明PinX1表达在人类细胞癌变中并无受到显著影响,与肿瘤细胞普遍发生的端粒酶重新活化的事件无关。通过设计强效特异的PinX1 shRNA,进一步研究在肿瘤细胞中抑制PinX1表达的生物学效应。发现在HepG2和HT1080两种端粒酶阳性肿瘤细胞中抑制PinX1表达造成端粒DNA长度的显著缩短,并显著降低这两种肿瘤细胞的裸鼠体内成瘤性和对DNA损伤诱导凋亡的耐受性。而抑制PinX1表达对端粒酶阴性的U20S肿瘤细胞的端粒长度及DNA损伤诱导凋亡的反应性无影响。本部分结果揭示出PinX1存在一种正调控端粒酶延长端粒DNA的新功能,其组成型表达与端粒酶阳性肿瘤细胞获得端粒稳定性和成瘤性相关。三、PinX1介导端粒酶延长端粒DNA的分子机制研究:端粒酶的端粒靶向性运输是目前端粒生物学领域未知的一个主要问题。我们在上一部分结果中揭示了PinX1存在一种促进端粒酶稳定端粒DNA长度的新功能。PinX1已被证明能够同时与端粒酶和端粒发生相互作用,提示其有可能是端粒酶与端粒间的桥联因子。TRF1是已知的与PinX1相互作用的端粒蛋白。但由于TRF1已被证明是端粒酶延长端粒的副调控因子,我们排除PinX1-TRF1相互作用是靶向端粒酶进行端粒DNA复制的机制,提示PinX1存在与其他端粒蛋白发生相互作用的可能。通过胞内蛋白质免疫共沉淀,发现PinX1能与端粒单链DNA结合蛋白Pot1形成复合物。通过shRNA抑制PinX1表达,发现能够显著减少胞内与Pot1偶联的端粒酶活性水平。进一步通过稳定表达PinX1-Pot1融合蛋白,证明能显著延长端粒酶阳性细胞的端粒长度,而对端粒酶阴性细胞的端粒长度无影响。与此同时,本实验室的其他成员证明了PinX1与Pot1存在直接蛋白质相互作用,特异性竞争抑制PinX1与Pot1的体内相互作用同样能降低胞内Pot1与端粒酶的结合水平并造成端粒酶阳性细胞的端粒长度缩短。综合以上结果,揭示出了PinX1-Pot1相互作用是介导端粒酶到达端粒的一条重要的胞内途径,是PinX1发挥正调控端粒酶复制延长端粒的分子机制。总结:本研究揭示出了PinX1具有介导端粒酶核仁定位和促进端粒酶复制延长端粒DNA的新功能。明确了PinX1组成型表达对端粒酶阳性肿瘤细胞稳定端粒长度和维持恶性生长表型有重要意义。鉴定出了PinX1-Pot1新相互作用,并证明这一蛋白质相互作用是细胞靶向端粒酶功能到达端粒的一条途径。同时提示了靶向PinX1介导的端粒酶端粒维持机制有可能作为抗肿瘤的一条新途径。