鸡是具有重要经济意义的家禽品种,其生长速度快,成熟早,产代间隔短,便于人们在短期内获得量多且质优的家禽产品。在许多发达国家和发展中国家,家禽是动物蛋白的主要来源。然而,鸡球虫病的广泛传播不仅危害了动物福利,也限制了全球养鸡业的发展,毒害艾美耳球虫(E.necat)rix是鸡球虫病的重要病原,在临床上常危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。近年来,在我国随着生长周期较长的黄羽鸡饲养数量的不断攀升,以及采用地面平养方式,使得由毒害艾美耳球虫引起的球虫病呈上升趋势,给养鸡业带来很大的经济损失,因此开展球虫病的防治研究至关重要。已有报道,柔嫩艾美耳球虫天然配子体抗原的单克隆抗体可以有效抑制配子体的受精过程,首次证实了艾美耳球虫配子生殖阶段抗原的免疫原性,且在近几年得到了广泛的研究。本文分析了毒害艾美耳球虫不同感染剂量下的卵囊产量情况;同时,克隆表达了毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam56;通过免疫保护性试验证实,体外重组表达的全长配子体蛋白rEnGAM56(rEnGAM56-F)对毒害艾美耳球虫的感染具有一定的免疫保护效果;同时将本研究室前期已验证并高效表达的rEnGAM56截短重组蛋白(rEnGAM56-T)进行免疫保护试验,探索并比较两种重组蛋白的免疫保护效果。最后,选取3种配子体抗原联合免疫鸡群,包括rEnGAM22、rEnGAM56-T和rEnGAM59,结果显示三种蛋白同时免疫的保护效果高于两种或一种蛋白免疫,进而为球虫多价亚单位疫苗的研制和开发奠定基础。1.不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响为研究不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响,设4个感染剂量组:500、2 500、5 000和10 000个孢子化卵囊/鸡;一个无感染阴性对照组,每组5只23日龄雏鸡。经鸡嗉囊接种卵囊。感染后鸡粪便中出现卵囊起至第16天,每天用麦克马斯特氏法对各组粪便中的卵囊进行计数;在感染后第16天扑杀鸡,取盲肠进行卵囊计数。结果显示,各试验组鸡均未发生死亡,但10 000个卵囊感染组的临床症状最为严重;感染后144 h粪便中查有卵囊,500、2 500和5 000个卵囊感染组均出现2个排卵囊峰值,10 000个卵囊感染组只出现1个峰值;各感染组在第7～13天产出的卵囊量均占总产量的94.74%以上;每只鸡粪便中排出的卵囊数随感染剂量的增加而增加,但单个卵囊的产量随感染剂量的增加而减少;感染后第16天,盲肠中卵囊数不到总卵囊量的1%。试验结果显示,在疫苗生产或增殖传代时,感染剂量可选择10000个卵囊/鸡,在感染后第7～13天收集粪便中卵囊。2.毒害艾美耳球虫Engam56基因的克隆与序列分析分离纯化毒害艾美耳球虫配子体,提取基因组DNA,分3段扩增Engam56基因,插入到T载体,挑取阳性克隆测序,将3段核苷酸序列进行拼接,获取Engam56基因全长序列。试验结果表明,Engam56基因全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,且为一个完整的开放阅读框,前20个氨基酸为信号肽,预测分子量大小约为58.0 kDa。抗原决定簇在线分析软件预测此编码蛋白共含有10个抗原决定簇,与巨型艾美耳球虫配子体蛋白EmGAM56和EmGAM82相类似,Engam56基因编码的蛋白也含有一个酪氨酸-丝氨酸和一个脯氨酸-甲硫氨酸富集区。其中,酪氨酸-丝氨酸富集区(第246～323位)位于1个完整的抗原决定簇中,且为10个抗原决定簇中最长;脯氨酸-甲硫氨酸富集区(第338～454位)内含有1个抗原决定簇。序列比对结果显示,Engam56与其他艾美耳属配子体蛋白编码基因的同源性为59.3%到99.2%。综合以上序列分析结果,扩增的Engam56基因确为配子体蛋白编码基因,且基因保守性较高。3.毒害艾美耳球虫Engam56基因的原核表达与鉴定经软件预测全长Engam56基因编码的氨基酸序列,去除信号肽,根据大肠杆菌的最适氨基酸密码子,优化合成,选取BamH I和Xho I酶切位点,插入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-Engam56。常规转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。试验结果显示,重组表达的蛋白大小约为58.0 kDa左右,且主要在包涵体中表达。Western blot检测结果显示,重组表达的蛋白能够被6×HIS标签单抗特异性识别,同时能被鼠抗重组蛋白多抗和毒害艾美耳球虫病鸡康复血清识别,证实此体外重组表达的蛋白为特异性表达的蛋白,且具有较好的免疫原性。4.毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM56的免疫保护分析黄羽肉鸡为试验动物,以病变记分、平均增重、卵囊产量,体液抗体水平和细胞因子变化等作为评价指标,将全长Engam56基因的重组蛋白rEnGAM56-F与研究室前期已成功诱导表达的截短Engam56基因的重组蛋白rEnGAM56-T同时进行免疫保护试验,并进行比较分析。结果显示,综合病变记分、平均增重、卵囊产量,rEnGAM56-T低剂量组(50μg)的免疫效果最佳;综合体液抗体水平和细胞因子水平,rEnGAM56-T中剂量组的效果最佳,其次为rEnGAM56-T低剂量组。结论:rEnGAM56-F和rEnGAM56-T重组蛋白对鸡群均具有一定的免疫保护效果,综合检测指标,重组蛋白rEnGAM56-T免疫效果优于rEnGAM56-F,以rEnGAM56-T中剂量组和低剂量组的免疫保护效果最佳。5.毒害艾美耳球虫三种重组配子体抗原的联合免疫保护分析黄羽肉鸡为试验动物,以攻虫前后的平均增重、相对增重率;攻虫后的病变记分与卵囊减少率等作为评价指标,初步研究了重组蛋白rEnGAM22、rEnGAM56-T、rEnGAM59的免疫保护效果,并检测了重组蛋白诱导产生的特异性抗体水平。结果显示,综合病变记分、平均增重,卵囊产量,rEnGAM(22+59+56-T)组的效果最佳,其次为rEnGAM22组和rEnGAM(22+56-T)组。而在体液抗体水平和细胞因子变化检测中,rEnGAM(22+59+56-T)组最佳,其次为rEnGAM(22+56-T)组和rEnGAM22组。结论:验证了蛋白联合免疫的效果优于蛋白单独免疫,其中3种蛋白联合免疫的效果优于2种蛋白,本试验研究为球虫多价亚单位疫苗的研制奠定了理论基础。