细胞自噬是细胞内物质循环的重要过程,简要来说,来自于内质网、高尔基体或者细胞膜等的双层膜结构包裹损伤的细胞器及蛋白等物质形成自噬体,自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,包裹物在溶酶体酸性水解酶的作用下降解后得以循环再利用。通常认为,MTOR是细胞自噬上游最重要的负性调控分子。雷帕霉素靶蛋白(MTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于磷酸肌醇3激酶(Ptd Ins3K)相关的激酶家族。MTOR与不同的蛋白结合形成MTOR复合物1(MTORC1)或者MTORC2,根据对雷帕霉素的敏感性不同,可分为对雷帕霉素敏感的MTORC1和对雷帕霉素不敏感的MTORC2。其中,MTORC1被认为是细胞自噬上游重要负性调控分子。机体和细胞能利用MTOR信号通路感知并整合外界因素如生长因子和营养状况的改变等影响,调控多种生理病理过程,如细胞自噬、基因转录、蛋白质合成、脂质体合成和细胞代谢等,从而调节细胞的生长和代谢,在肿瘤、肥胖、2型糖尿病和衰老等疾病发生发展中发挥重要调控作用。近年来,越来越多的研究已证实MTOR-细胞自噬信号通路在多种呼吸系统疾病中发挥重要作用,包括慢阻肺、急性肺损伤、肺纤维化等。然而目前对MTOR-细胞自噬信号通路在哮喘和大气颗粒物(PM)诱导的气道炎症中的作用仍所知甚少。哮喘是全球发病率增长最快的疾病之一,是一种以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等炎症细胞参与,气道粘液高分泌、气道重构和气道高反应性为特征的慢性气道炎症性疾病。现有的临床治疗方案通常能控制哮喘症状,但是很难根治。哮喘的发病机制错综复杂,通常认为主要涉及Th1/Th2细胞免疫失衡。近年来,气道上皮细胞在哮喘中的作用越来越引起重视,被认为在哮喘起始和疾病进展中发挥关键作用,研究指出气道上皮细胞损伤会影响整个呼吸系统的完整性,损伤的气道上皮细胞会释放更多促炎介质如IL25、IL33及Eotaxins等,启动或加重哮喘炎症。虽然气道上皮细胞的损伤在哮喘的发生发展中发挥重要作用,但是目前对哮喘气道上皮细胞损伤的调控机制研究并不多。空气污染是严重危害人类健康的重要因素,其中PM是大气污染的重要组成部分。不同粒径的PM均能携带有毒有害物质通过人类呼吸进入人体,沉积在气道或者进入肺部引起或者加重肺部疾病,且PM粒径越小能传播地越远,可通过血液系统进入其他脏器。流行病学调查发现PM是引起呼吸系统疾病、心血管疾病及癌症发病率上升和死亡率增加的重要因素之一。因此,通过进一步研究哮喘和PM引起气道损伤的发病机制,将有望为这两种疾病的防治提供新的有效策略,为新药物的研发提供理论指导和实验依据。关于MTOR-细胞自噬信号通路是否在哮喘中发挥作用,有研究报道自噬相关基因(ATGs)的基因表达和哮喘存在相关性,并且在哮喘病人的气道上皮细胞和成纤维细胞中发现有自噬体数量的增加。然而,另一个研究发现体内CD11C~+细胞中特异性敲除ATG5的小鼠能被HDM诱导发生IL17A依赖性的中性粒细胞性哮喘炎症,提示细胞自噬在哮喘中的作用可能是细胞依赖性的,即不同细胞中的细胞自噬在哮喘中发挥不同的作用。而有一些研究也表明MTOR的抑制剂Rapamycin能够减轻哮喘炎症,然而其他研究却发现当Rapamycin用作肾移植后的免疫抑制剂时,Rapamycin会普遍引起肺损伤,提示可能与细胞自噬一样,MTOR在哮喘中的作用亦因细胞不同而不同。这与既往研究结论是相符的,即MTOR-细胞自噬信号通路在呼吸系统疾病中的作用表现为“双刃剑”,可在不同的细胞和不同的病原体诱导损伤模型中发挥不同的调控作用,既有保护性作用又有损伤性作用。此外,我们团队前期研究已证实在气道上皮细胞中,细胞自噬能介导PM诱导的气道炎症和粘液高分泌的发生,但是目前对于MTOR是否在PM诱导的气道炎症中发挥作用以及是否通过下游细胞自噬起作用等问题尚不清楚。因此,本研究中,我们将在气道上皮细胞中研究MTOR-细胞自噬信号通路在哮喘和PM诱导的气道炎症中的作用及相关分子机制。第一部分气道上皮细胞MTOR抑制细胞自噬介导IL25产生从而减轻哮喘炎症目的:气道上皮细胞是在哮喘发生发展中发挥关键作用的细胞,然而具体机制仍所知不多,因此我们将研究气道上皮细胞MTOR-细胞自噬信号通路在哮喘中的作用,并深入探索相关分子机制。方法:我们检测了哮喘病人、哮喘模型小鼠以及IL13/IL33干预后的气道上皮细胞中MTOR-细胞自噬信号通路相关蛋白的改变,同时我们成功构建了MTOR气道上皮细胞特异性敲除小鼠,利用该小鼠和LC3B敲除小鼠建立OVA或HDM诱导的哮喘模型,观察气道上皮细胞MTOR-细胞自噬信号通路在哮喘中的作用,并且开展了相关机制研究。结果:我们证实哮喘病人和哮喘模型小鼠气道上皮细胞及IL13或IL33诱导的HBE细胞中,MTOR活性下降,细胞自噬水平增加。而且,进一步研究提示上游TSC2活性增加可能引起了MTOR-细胞自噬信号通路的改变。气道上皮细胞MTOR特异性敲除能恶化哮喘炎症,而抑制细胞自噬能减轻哮喘炎症,且MTOR至少部分是依赖其下游的细胞自噬起作用的。更进一步研究还证实气道上皮细胞中MTOR敲除是通过上调,而细胞自噬是通过下调IL25的表达从而分别恶化和缓解哮喘炎症。结论:在气道上皮细胞中,某些过敏性炎症相关因子如早期产生的IL33或者后期产生的IL13等,能够通过促进TSC2活化,从而抑制MTOR活性,诱导细胞自噬。细胞自噬能够促进IL25的产生,加重哮喘炎症。因此,在气道上皮细胞中激活MTOR或者抑制细胞自噬均能作为哮喘炎症的治疗手段。第二部分抑制MTOR活化能促进细胞自噬介导PM诱导气道炎症目的:PM能进入气道和肺泡中破坏气道屏障,诱导氧化应激、细胞自噬、DNA损伤和基因组不稳定性的发生,但是目前对于PM引起气道损伤的机制仍所知甚少,因此我们将研究MTOR-细胞自噬在气道上皮细胞损伤中的作用及其在PM诱导的气道炎症中的作用并深入探索相关分子机制。方法:首先,我们检测了PM诱导的气道炎症小鼠以及PM干预后的气道上皮细胞中MTOR-细胞自噬信号通路相关蛋白的改变。同时在体内实验中,我们成功构建了MTOR和ATG5气道上皮细胞特异性敲除小鼠,利用这2种小鼠建立PM诱导的气道炎症模型,观察气道上皮细胞MTOR-细胞自噬信号通路在PM诱导的气道炎症中的作用。而在体外实验中,我们利用si RNA特异性敲除目的基因和相关抑制剂干预等方法抑制气道上皮细胞MTOR-细胞自噬信号通路活化,从而观察MTOR-细胞自噬信号通路在PM诱导的气道上皮细胞损伤中的作用并深入探索可能的分子机制。结果:我们证实在HBE细胞和小鼠气道上皮细胞中,PM抑制MTOR活化,诱导细胞自噬的发生,同时用体内体外实验共同证明抑制MTOR能恶化PM诱导的气道炎症,而抑制细胞自噬能减轻PM诱导的气道炎症,并且MTOR是依赖其下游的细胞自噬起作用的。进一步研究结果表明PM通过促进TSC2的活化,从而抑制MTOR活化,诱导细胞自噬的发生。PM还能通过TLR4-MYD88信号通路与MTOR-细胞自噬信号通路相互作用共同调控NFKB信号通路的活化,进而调控PM诱导的炎症反应。此外,细胞自噬还能通过上调EPS15的表达促进PM内吞,与TLR4信号通路相互作用共同调控PM诱导的溶酶体损伤。结论:气道上皮细胞MTOR-细胞自噬信号通路在PM诱导的气道炎症发挥重要调控作用,因此,在气道上皮细胞中激活MTOR或者抑制细胞自噬均能减轻PM诱导的气道炎症。