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在高等植物中,脂肪氧合酶氧化多不饱和脂肪酸产生氢过氧化物,其随后被氢过氧化物裂解酶(Hydroperoxide lyase, HPL)催化裂解生成己醛、己烯醛。这些挥发性醛类物质又被称为绿色信号,具有果蔬的新鲜气味,是食品行业和日化工业中的重要芳香风味添加剂。本文从HPL的筛选及稳定化入手,展开了酶的分离纯化、酶学性质、活性部位关键性氨基酸、催化机理以及高盐浓度下酶的动力学和稳定性的研究。首先在不同蔬菜中进行HPL活力的筛选,发现苋菜为富含13-HPL活力的原料,酶活以13-亚麻酸氢过氧化物和13-亚油酸氧过氧化物计分别为1.92±0.12U/g和0.92±0.08U/g。添加甘油和DTT的液态HPL可在-20℃下保存20天并维持80%的酶活。在冷冻干燥之前进行表面活性剂剥离后加入蔗糖,可保证冻干前后酶活基本维持不变,冻干样品在-20℃下酶活可维持40天不变。添加蔗糖的冻干酶粉,经DEAE-Toyopearl柱层析、苯基琼脂糖柱层析和羟基磷灰石柱层析进行分离纯化。SDS-PAGE电泳图谱及二维电泳表明HPL的分子量约为55kDa、等电点为5.4左右。该酶的最适pH为6.0,最适温度为25℃。对于其最适底物13-亚麻酸氢过氧化物,Km值为62.7μmol/L ,Vmax为178.5μmol·min-1·mg-1。化学修饰结果表明丝氨酸、赖氨酸、半胱氨酸对HPL活性有重要影响,其产物2-(E)-己烯醛也能明显降低酶的活性,EDTA、己醛、氮乙酰咪唑和碳化二亚胺对酶活影响不大。抑制动力学实验结果检测表明对氯汞苯甲酸钠(p-Chloromercuribenzoate, PCMB)为竞争性抑制剂,由此推论巯基为HPL活性中心起关键作用的基团,在催化过程中起重要作用,和底物结合相关。且圆二色光谱和荧光光谱表明经PCMB修饰后HPL的α-螺旋下降,表面疏水性下降。针对HPL反应转化率不高展开了深入的研究,结果表明在反应过程中HPL受攻击引起结构变化导致表面疏水性下降,HPL催化反应属典型的自杀型抑制反应。13-亚油酸氢过氧化物对HPL产生了不可逆抑制,抑制符合伪一级模型,失活速率常数为16.133 M-1s-1。抗氧化剂二硫苏糖醇、半胱氨酸,自由基清除剂BHT、BHA对于HPL的失活作用有一定的保护效果,同样说明巯基位于HPL的活性中心,且反应过程中可能有自由基的产生。后通过电子自旋共振实验进一步证实在反应过程中产生烷基自由基和烷氧自由基混合物,且信号强烈,添加DTT和BHT有一定的自由基清除的效果。无机盐离子对苋菜HPL有明显的激活作用并能提高其热稳定性。总体来说kosmotropic阴离子的影响大于chaotropic阳离子。盐对HPL酶活性和酶热稳定性的影响都遵循霍夫密斯特序列,疏水相互作用力、静电相互作用力和特异性离子分散力对于作用效果起主要贡献作用。这其中包含的主要机制是:离子会影响酶分子周围水分子层,进而和酶表面以及内部结构发生相互作用,提高酶的活性和稳定性,在1.0mol/L的磷酸盐作用下,酶表面疏水性增加,通过疏水相互作用力在水中形成一个表面以疏水结构为主的天然刚性态,稳定性增加。