论文部分内容阅读
目的:矽肺是尘肺病的一种,通常是由于长期暴露于结晶型二氧化硅所致。矽肺的特征性表现为活化的纤维母细胞产生的细胞外基质过度沉积所引起的慢性炎症和不可逆转的肺纤维化。尽管在矽肺的整个病程中维持着显著的炎症反应,但是一旦纤维化形成,仅有的抗炎治疗不能延缓甚至会恶化纤维化进程。最近研究证实,过度的细胞外基质沉积对纤维母细胞增殖活化所介导的持续性纤维化起到积极促进的作用,然而其具体的分子机制还有待进一步探索。本研究从纤维母细胞活化和矽肺纤维化之间的正反馈调节入手,探究细胞外基质合成,基质硬度增加对矽肺纤维化进展的调控机制,以期为延缓矽肺纤维化进程提供新的理论依据和潜在分子靶点。研究方法:本研究通过非暴露气管灌注结晶性二氧化硅悬液构建实验性矽肺小鼠模型。应用Western blot、免疫组化分析,检测矽尘暴露矽肺模型小鼠肺组织中YAP的胞核胞浆表达和定位改变。利用小鼠纤维母细胞系NIH-3T3进行体外实验。通过软硬凝胶培养NIH-3T3,模拟体内正常及纤维化损伤的肺组织基质硬度环境。应用免疫荧光分析,进一步验证基质硬度对YAP表达及定位的影响;通过生物信息学分析预测与基质硬度调控YAP相关的蛋白,并以此为靶点,探索CD44-RhoA-F-actin-YAP信号通路。通过免疫荧光和Western blot检测逐步沉默通路靶蛋白CD44,RhoA,抑制F-actin聚合对下游信号通路及效应因子YAP的影响;共转染RhoA持续性活化质粒和CD44小干扰RNA于硬胶培养的NIH-3T3细胞,给予F-actin阻聚剂于转染RhoA持续性活化质粒的NIH-3T3细胞,通过免疫荧光和Western blot检测效应因子YAP的表达和定位改变,进一步证实通路的上下游关系。通过免疫荧光检测通路上下游阻断对YAP定位的影响;通过划痕和Trans-well实验检测通路上下游阻断对NIH-3T3迁移能力的影响;通过Western blot、CCK8分析和流式细胞术检测通路上下游阻断对NIH-3T3增殖和凋亡的影响;利用荧光素酶报告基因分析检测通路上下游阻断对Smads基因转录活性的改变,进一步证实阻断处理对TGF-β-Smad信号通路的改变;利用Realtime-PCR检测阻断处理对促炎及促纤维化基因的改变。分别给予实验性矽肺模型小鼠CD44中和抗体、YAP小分子抑制剂维替泊芬(VP)和梯度剂量的二氢丹参酮(DHI),构建信号通路上下游分别阻断模型。分别提取小鼠肺组织胞核胞浆蛋白,通过Western blot检测阻断处理对效应因子YAP核浆表达的改变;提取小鼠肺组织总蛋白,通过Western blot检测阻断处理对Smads家族相关蛋白的影响;通过对小鼠肺功能相关指标的记录,动态观察上下游阻断对矽肺小鼠受损肺功能的改善;利用Masson染色和Collagen 1、Fibronectin免疫组化分析,观察上下游阻断对矽肺小鼠肺组织纤维化的影响;利用羟脯氨酸测定辅助证实小鼠纤维化水平的改变;利用HE染色分析,观察阻断处理对矽肺小鼠肺组织炎症变化的影响;应用ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液中相关促炎因子的改变辅助证实小鼠炎症水平的变化。结果:1、实验性矽肺模型小鼠肺组织中YAP核内定位及表达增强。应用Western blot和免疫组化分析,观察矽尘暴露小鼠肺组织中YAP蛋白的定位及表达情况。结果显示,矽尘暴露56天,矽肺模型组小鼠肺组织中YAP蛋白核内表达水平明显增高(P<0.05);免疫组化定位分析显示,YAP的核内定位主要集中在矽肺矽结节的纺锤形细胞区域,说明YAP在纤维母细胞中的高表达。2、细胞外基质蛋白可通过CD44调控RhoA蛋白家族活化,进而影响YAP的定位及表达。应用生物信息学分析,检测出参与调控基质蛋白与YAP相互作用的关键靶蛋白CD44。体内外免疫荧光结果显示,基质硬度增加使CD44表达增强。通过逐级沉默通路蛋白CD44和Rho家族蛋白(RhoA,Rac1和Cdc42),应用免疫荧光和Western blot检测下游通路及靶蛋白YAP的改变,结果证实CD44通过调控RhoA亚家族而影响YAP的定位及表达,Rac1和Cdc42亚家族在此过程中无显著作用。3、RhoA通过影响F-actin的聚合/解聚,进而直接调控靶蛋白YAP。分别沉默Rho家族蛋白(RhoA,Rac1和Cdc42),免疫荧光和Western blot结果显示,只有沉默RhoA可以影响下游F-actin及效应因子YAP的表达。通过F-actin阻聚剂Lat A处理,应用免疫荧光和Western blot检测下游Hippo通路激酶链Mst 1,Lats 1蛋白及效应蛋白YAP的改变,结果显示F-actin不通过Hippo通路激酶链而直接调控YAP的定位及表达。4、上下游反转实验证实基质硬度通过CD44-RhoA-F-actin信号通路调控靶蛋白YAP的定位及表达。共转染RhoA持续性活化质粒与CD44小干扰RNA于NIH-3T3细胞;利用Lat A处理RhoA持续性活化NIH-3T3细胞。通过免疫荧光和Western blot检测,进一步证实CD44-RhoA-F-actin信号通路的上下游关系。CD44通过调节RhoA的活化,进而影响F-actin的聚合和解聚,此过程参与调控基质硬度增加与YAP活化的正反馈。5、CD44-RhoA-YAP信号通路上下游阻断可抑制基质硬度介导的纤维母细胞功能活化。利用CD44中和抗体从上游阻断通路;利用YAP小分子抑制剂维替泊芬以及梯度二氢丹参酮从下游阻断通路;利用YAP小干扰RNA作为阳性对照。细胞划痕实验和Trans-well实验结果显示,通路上下游阻断可抑制基质硬度诱导的纤维母细胞迁移;Western blot检测Collegen 1,MMP2及其抑制物TIMP2结果显示,阻断处理可降低Collegen 1,MMP2的表达同时增加TIMP2的表达,具有统计学意义(P<0.05);CCK8分析和流式细胞术实验结果显示,纤维母细胞的增殖水平的下调主要由下游通路阻断介导,而凋亡水平的上调主要由上游通路阻断介导的(P<0.05);荧光素酶报告基因实验结果显示,上下游阻断可抑制纤维母细胞Smads的转录活性(P<0.05)。6、CD44-RhoA-YAP信号通路上下游阻断抑制促炎和促纤维化细胞因子的表达利用CD44中和抗体、维替泊芬以及梯度二氢丹参酮从上下游阻断信号通路。Realtime-PCR分析结果显示,阻断处理可下调促炎及促纤维化因子Tgf-β1,Pai,Il-6,Il-8,Fibronectin和Collagen-1a1的表达(P<0.05)。7、CD44-RhoA-YAP信号通路上下游阻断可调控YAP的核浆表达水平。分别利用CD44中和抗体、维替泊芬和梯度剂量的二氢丹参酮处理实验性矽肺模型小鼠,Western blot检测肺组织核浆蛋白提取物中YAP的表达水平。结果显示,上下游阻断可以降低组织核蛋白中YAP的表达而相应的增加组织浆蛋白中YAP的表达(P<0.05)。8、CD44-RhoA-YAP信号通路上下游阻断可下调实验性矽肺模型小鼠肺组织中Smads蛋白表达水平。分别利用CD44中和抗体、维替泊芬和梯度剂量的二氢丹参酮处理实验性矽肺模型小鼠,Western blot检测肺组织总蛋白中Smads家族蛋白的表达水平。结果显示,上下游阻断可以抑制Samd2的磷酸化,而提高抑制性Smad7蛋白的表达(P<0.05)。9、CD44-RhoA-YAP信号通路上下游阻断可改善实验性矽肺模型小鼠的肺功能及炎症纤维化水平。通过对实验小鼠肺功能指标分钟通气量(MV),潮气量(TV)和呼吸频率(f)的实时记录,结果表明阻断处理可改善矽肺小鼠的肺功能水平。HE及Masson染色检测肺组织炎性浸润及胶原沉积,结果表明与矽肺模型组相比,阻断处理可减轻矽尘所致的炎性及纤维化症状。ELISA法检测结果显示,阻断处理可降低小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎性因子TNF-α,IL-6和IL-1β的表达(P<0.05),支持了HE染色结果。免疫组化法检测结果显示,阻断处理可降低肺组织Fibronectin和Collagen 1的表达,羟脯氨酸检测显示,阻断处理可降低肺组织羟脯氨酸的含量,支持了Masson染色结果。结论:1、CD44-RhoA-YAP信号通路参与调控基质硬度介导的纤维母细胞活化的过程。2、上下游阻断此信号通路可以影响纤维母细胞的活化和功能。3、上下游阻断此信号通路可以改善矽尘所致的小鼠肺功能损伤以及肺部炎症及纤维化症状,为矽肺治疗提供潜在的治疗策略。