论文部分内容阅读
miR396家族是植物体内最为保守的miRNA家族之一,它在植物的生长发育中发挥重要的调控作用。拟南芥miR396的靶基因主要有两类：7个GRF和bHLH74转录因子。bHLH74是bHLH转录因子(basic Helix-Loop-Helix Transcrition Factor)家族的成员,同时也被称为细胞伸长促进因子2(Activator 2 For Cell Elongation).前期数据表明miR396/bHLH74模块参与调控拟南芥根伸长区细胞伸长,但关于其它的生物学功能及相关机制目前仍知之甚少。本研究以拟南芥miR396及其靶基因的各种突变体为材料,探究miR396如何通过靶基因bHLH74以及相关激素信号途径参与调控下胚轴细胞伸长,获得了以下主要结果：1拟南芥miR396通过介导bHLH74的抑制负调控下胚轴细胞伸长1.1 bHLH74转录因子促进细胞伸长对6天大的幼苗进行了下胚轴表型的观察,结果显示,与野生型相比,靶基因功能缺失突变体bhlh74-1植株的下胚轴长度及两片子叶大小明显缩短,而过表达株系35S:mbHLH74的下胚轴长度明显比野生型长,说明bHLH74转录因子是植物组织细胞伸长的促进因子。1.2在黑暗条件下miR396通过抑制bHLH74负调控下胚轴的伸长miR396过表达转基因拟南芥OX396a和OX396b幼苗,经黑暗培养6天后,下胚轴长度明显短于野生型,且下胚轴部位靶基因bHLH74的表达水平也明显下调。miR396过表达株系的下胚轴表型与突变体bHLH74-1相似,说明miR396可通过介导靶基因bHLH74的抑制负调控下胚轴伸长。1.3 miR396通过bHLH74转录因子负调控BR信号通路中相关基因的表达对BR信号通路中促进细胞伸长的下游基因进行定量RT-PCR检测,结果显示,在突变体bhlh74-1与过表达株系OX396α#7的下胚轴中EXPl.EXPL2.EXP8和XTH4的表达明显下调。说明miR396通过介导bHLH74转录后抑制,负调控BR信号途径中bHLH74下游相关基因的表达,抑制下胚轴细胞伸长。2拟南芥miR396通过BR信号途径参与细胞伸长的调控2.1黑暗条件下miR396通过增强对外源BR信号的敏感性负调控下胚轴伸长在黑暗条件下,突变体bhlh74-1和过表达株系OX396a#7和OX396b#8幼苗下胚轴的伸长对外源激素BR信号更为敏感,且BR信号通路中的下游促进细胞伸长的相关基因表达也显著下调,抑制下胚轴伸长。2.2持续光照条件下miR396改变对外源BR信号的敏感性影响子叶大小在持续光照条件下,外源BR处理促进突变体bhlh74-1及过表达株系OX396α#7与OX396b#8子叶的生长,抑制野生型子叶的生长；说明持续光照培养下miR396水平的高低影响拟南芥对BR信号的敏感性调控子叶大小。2.3 miR396通过影响下胚轴对温度的敏感性调控其伸长野生型下胚轴伸长对温度比较敏感,在20～30℃C范围内,随着温度的升高其长度不断增加；而突变体bhlh74-1及miR396的过表达株系则表现出对温度的不敏感,其下胚轴长度变化不显著。说明miR396可以通过影响下胚轴对温度的敏感性调控其伸长。2.4外源激素及环境温度影响拟南芥miR396的表达外源激素处理实验发现,1 nM的外源eBL可诱导拟南芥地上部分miR396b的表达；2,4-D处理增强幼苗根部miR396a的积累,抑制地上部分miR396a/b的表达。黑暗条件下,外源2,4-D与GA诱导拟南芥下胚轴部位miR396b的表达。此外,温度变化也影响拟南芥下胚轴部位miR396b的表达。说明miR396在不同组织的积累受到多种激素和环境因素的影响。综合上述数据及miR396相关功能研究结果,本研究提出了一个miR396/bHLH74通过BR信号通路调控拟南芥下胚轴伸长的模型。miR396通过对靶基因bHLH74的转录后抑制,可能影响其与BR途径中转录因子IBHl和PIF4的相互作用,下调下游促进细胞伸长相关基因EXP1、EXPL2等的表达,抑制下胚轴伸长,并引起下胚轴伸长对BR和外界温度变化的敏感性的变化；同时miR396自身的表达也受到Auxin、BR和GA等多种激素及外界温度的调控。miR396/bHLH74调控模块的研究,为BR信号途径调控下胚轴细胞伸长的网络提供了一个新的思路。