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目的:研究白细胞介素-36α(Interleukin 36 alpha,IL-36α)在真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK)中的表达及其作用。方法:1、刮取真菌性角膜炎患者角膜上皮、角膜移植术后剩余的健康供体周边角膜上皮,分别提取mRNA,实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-36αmRNA表达。HE染色(Hematoxylin-Eosin Staining)观察真菌性角膜炎患者角膜组织病理变化,并采用免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry,IHC)检测人角膜组织中IL-36α蛋白表达。烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,AF)感染C57BL/6小鼠角膜建立真菌性角膜炎动物模型,观察感染1、3、5天小鼠角膜炎症情况并记录临床评分,分别采用RT-PCR或蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测真菌感染组小鼠角膜和损伤对照组小鼠角膜中IL-36αm RNA或蛋白表达,进一步采用免疫荧光染色(I mmunofluorescence,IF)明确损伤对照组和感染3天小鼠角膜中IL-36α表达及定位。2、外源性IL-36α重组蛋白(Recombinant Mouse IL-36 alpha,rm IL-36α)或IgG重组蛋白预处理小鼠角膜后建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,于裂隙灯下观察建模后3天小鼠角膜炎症情况并记录临床评分,MPO检测小鼠角膜中性粒细胞数量。3、分别检测IgG+损伤对照组、IgG+AF组及rmIL-36α+AF组小鼠在感染后3天角膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白的表达。4、烟曲霉菌灭活菌丝刺激小鼠R AW264.7巨噬细胞并检测细胞中IL-36αmRNA及蛋白表达;外源性rmIL-36α处理巨噬细胞,检测细胞中促炎因子IL-1β和IL-6表达变化;rmIL-36α预处理小鼠RAW264.7巨噬细胞后加入烟曲霉菌灭活菌丝刺激细胞,并检测细胞中IL-1β及IL-6表达。5、外源性IL-36Ra重组蛋白(Recombinant Mouse IL-36Ra,rm IL-36Ra)预处理小鼠RAW264.7巨噬细胞阻断IL-36受体(IL-36 receptor,IL-36R)后分别给予rmIL-36α或烟曲霉菌灭活菌丝刺激细胞,检测各组细胞中IL-1β、IL-6表达。结果:1、真菌性角膜炎患者角膜上皮中IL-36αmRNA表达较正常对照组明显升高;免疫组化显示真菌感染的人角膜组织中IL-36α蛋白表达明显高于正常角膜,且主要定位于角膜上皮。裂隙灯下观察可见,与损伤对照组小鼠角膜相比,烟曲霉菌感染的小鼠角膜溃疡面积增大、混浊程度加重、临床评分升高,并于感染后3天达高峰,同时感染角膜组织中IL-36αm RNA及蛋白表达水平明显升高,趋势与角膜炎症程度一致;免疫荧光结果显示感染后3天的小鼠角膜中IL-36α蛋白表达较损伤对照组明显升高,且主要定位于角膜上皮。2、与IgG+AF组相比,rmIL-36α+AF组小鼠角膜缺损区溃疡面积增大,缺损区周边角膜混浊程度加重,临床评分升高,MPO水平升高。3、rmIL-36α+AF组小鼠角膜组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显高于IgG+AF组。4、与空白对照组相比,烟曲霉菌灭活菌丝刺激的小鼠264.7RAW巨噬细胞中IL-36α表达显著升高。外源性rmIL-36α处理巨噬细胞后,细胞中I L-1β、IL-6表达明显高于IgG对照组,但低于IgG+AF组;rmIL-36α+AF组巨噬细胞中IL-1β、IL-6表达显著高于IgG+AF组。5、与rmIL-36α组相比,rmIL-36Ra+rm IL-36α组细胞中IL-1β、IL-6水平均下降;rmIL-36Ra+AF组细胞中IL-1β、IL-6表达较IgG+AF组明显降低,差异均有统计学意义。结论:1、IL-36α参与真菌性角膜炎的炎症反应。2、IL-36α可促进角膜组织中性粒细胞募集,并引起促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α高表达。3、IL-36α可通过IL-36R调节烟曲霉菌介导的炎症细胞因子IL-1β、IL-6表达。