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研究背景:口腔颌面部的肿瘤、外伤、炎症引起的牙槽骨缺损及牙周炎、缺牙后引起的牙槽骨萎缩比较常见,常导致患者的美学、发音、咀嚼等功能障碍,严重影响患者的身心健康。现阶段牙槽骨缺损的修复方式主要包括自体骨移植和骨替代材料移植,自体骨移植具有良好的骨传导及骨诱导性,是修复骨缺损的“金标准”,但存在一定的弊端,如开辟第二术区、骨量不足、供区感觉障碍等;骨替代材料缺乏骨诱导性,并且可以引发免疫排斥反应。组织工程技术的出现,为口腔颌面部骨缺损的修复带来了希望。然而,作为组织工程三要素之一的种子细胞在应用中,依然面临着很多的问题,如其移植后成活率差、定向分化效率低、分化方向难以控制。之前的研究多使用各种生长因子或药物来诱导干细胞的成骨分化,然而,单纯的某种生长因子对干细胞的诱导分化能力有限,并且可能产生一定的副作用,如成骨过量,潜在的成瘤风险。越来越多的研究表明,间充质干细胞条件培养基（conditioned medium,CM）中包含的大量生物活性分子可以刺激骨缺损区的细胞增殖、迁移、细胞分化,可以弥补传统使用的单一生长因子及药物的诸多不足之处。然而,间充质干细胞CM中生长因子的有效浓度不足也限制了其临床转化,学者们常通过定向诱导、炎症刺激等方式优化干细胞分泌生长因子的浓度及种类。牙囊干细胞（dental follicle stem cell,DFSC）来源于外胚间充质,是新近研究的牙源性干细胞,DFSC及其CM在牙及牙周组织再生、神经组织再生、免疫调控方面有着独特的优势,具有广阔的应用前景。然而,DFSC分泌的细胞因子多样,如何调控DFSC,优化其分泌的生物活性因子定向发挥作用,是目前仍需解决的问题。淫羊藿苷（icariin,ICA）是中药淫羊藿的有效成分。ICA作为天然雌激素,已被证实可以促进骨形成,抑制骨吸收。ICA在骨组织工程领域应用广泛,常作为骨诱导因子被加载到组织工程支架中发挥作用。近年来研究表明,ICA可以激活Wnt/β-catenin信号通路,MARK信号通路、Notch信号通路等多种途径,刺激骨髓间充质干细胞分泌特殊的细胞因子,促进骨形成,抑制骨吸收。然而,ICA作为骨诱导因子,能否优化DFSC分泌细胞活性因子,发挥定向成骨的作用,尚少见报道。实验目的:研究ICA诱导的人牙囊干细胞条件培养基（DFSC-CM）对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）增殖、迁移,成骨分化的影响,探讨ICA诱导的DFSCCM作为干细胞定向成骨分化诱导因子的可行性。实验方法:牙囊组织由5名捐赠者提供（年龄3～9岁）。5名患者于吉林大学口腔医院口腔颌面外科行“上颌前部埋伏多生牙拔除术”,术中拔除多生牙的同时刮除牙囊组织,冰上转运至实验室。首先通过酶消化法和组织块法,分离培养DFSC,通过免疫细胞化学和流式细胞术鉴定DFSC来源;通过成骨成脂肪诱导鉴定DFSC的多向分化能力;然后分别使用0μM、1μM和10μM的ICA处理DFSC,血清剥夺24 h后收集培养上清制备DFSC-CM。实验分为6组,分别为空白组（含有10%FBS、1%青-链霉素的完全培养基）、0ICA-CM组（含0μM ICA的DFSC-CM）、1ICA-CM组（含1μM ICA的DFSC-CM）、10ICA-CM组（含10μM ICA的DFSC-CM）、1ICA组（含1μM ICA的完全培养基）、10ICA组（含10μM ICA的完全培养基）;通过CCK-8法和结晶紫染色检测ICA诱导的DFSCCM对MC3T3-E1细胞的增殖活性的影响;通过划痕实验和Transwell小室实验检测ICA诱导的DFSC-CM对MC3T3-E1细胞的迁移能力的影响;通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测MC3T3-E1细胞成骨相关基因的表达情况。实验结果:1.DFSC阳性表达间充质来源的波形丝蛋白,阴性表达上皮来源的角蛋白;DFSC表面标志物阳性表达间充质干细胞表面抗原CD90、CD105;阴性表达造血干细胞表面抗原CD34、CD45;DFSC可以向成骨、脂肪方向分化;2.在增殖实验中,与空白组比较,第1天时,0ICA-CM组和1ICA-CM组均促进了MC3T3-E1细胞的增殖,1ICA-CM组的促进效果更明显,具有统计学差异;在第3天和第5天时,0ICA-CM组和1ICA-CM组均明显促进了MC3T3-E1细胞的增殖,但两者无统计学差异;3.在迁移实验中,0ICA-CM组和10ICA-CM组均促进了MC3T3-E1细胞的横向迁移,具有统计学差异;并且1ICA-CM组明显促进了MC3T3-E1细胞的纵向迁移;4.qRT-PCR实验中,与其他组相比,1ICA-CM组上调了Runx2、Ocn、Opn的m RNA表达水平。实验结论:多生牙来源的DFSC具有间充质干细胞特征,有可能成为间充质干细胞临床应用的候选种子细胞;ICA诱导的DFSC-CM促进了MC3T3-E1细胞增殖、迁移和成骨分化,ICA诱导的DFSC-CM可作为干细胞定向成骨分化的诱导因子,为其他干细胞成骨分化提供了基础。