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背景:阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)是最常见的神经退行性疾病,它的主要病理特征是在脑中形成大量神经纤维缠结和老年斑,而老年斑的主要成分是含β折叠结构的淀粉样多肽(β-amyloid,Aβ),主要分布于海马和皮层。大量研究证实,Aβ可通过炎症反应、氧化应激、诱导细胞凋亡等机制产生神经毒性作用。小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞,参与脑内炎症反应,保持内环境稳定。但Aβ是否影响小胶质细胞以及如何产生炎症反应损伤神经元的具体机制尚不清楚。目的:探讨Aβ如何通过炎症反应导致神经元损伤和动物记忆障碍。方法:使用免疫印迹法(Western blotting)检测脑组织和细胞中蛋白质水平;使用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光双/三标记法(Immunofluorescence double/triple labeling)检测海马中蛋白质的表达量、分布以及细胞类型特异性表达;使用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞和组织中的炎症因子含量;使用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)检测细胞内蛋白质与DNA的结合水平;用高尔基染色观察神经元树突棘的形态和数目;模仿血清药理学方法用给药后的小胶质细胞培养液处理神经元,确定小胶质细胞对神经元的影响;使用新事物识别试验(New object recognition,NOR)检测小鼠的学习记忆功能。结果:1.侧脑室单次注射Aβ42在急性期损伤小鼠的学习记忆功能在2月龄C57小鼠侧脑室注射老化的Aβ42,并在注射后24 h和7天分别检测小鼠的认知功能。结果显示,与溶剂(DMSO)注射的对照组相比,Aβ42注射后24 h组小鼠学习记忆功能明显受损,而Aβ42注射后7天组小鼠与对照组比无显著差异。2.侧脑室注射Aβ42后不同时间点对突触相关蛋白表达呈现不同的影响侧脑室注射老化的Aβ42后24 h,7天和14天后,用western blotting分别检测小鼠海马组织中突触相关蛋白的表达水平。与对照组相比,Aβ42注射24 h组Glu A2水平明显下降,同时伴有p S133-CREB的明显增高;高尔基染色显示树突棘数量明显减少。Aβ42注射后7天组的突触相关蛋白表达水平与对照组无显著差异。Aβ42注射14天组可见Glu N2B的降低。3.侧脑室注射Aβ42在急性期激活小胶质细胞侧脑室注射Aβ42后24 h和7天后分别用小胶质细胞标志物Iba1进行免疫组化检测,发现24 h组小鼠的小胶质细胞数量显著增加;细胞直径变大,约为对照组的1.5倍;而7天组小鼠小胶质细胞的数量和形态与对照组比无显著差异。4.侧脑室注射Aβ42在急性期不改变星形胶质细胞和神经元的数量侧脑室注射老化Aβ42后24 h,分别用星形胶质细胞和神经元的标记物GFAP和Neu N进行免疫组化染色。结果显示,与对照组比,星形胶质细胞和神经元的数量均无明显改变。5.侧脑室注射Aβ42在急性期升高小胶质细胞的p S133-CREB表达水平侧脑室注射老化Aβ42后24 h,发现小鼠海马区小胶质细胞中p S133-CREB表达水平显著升高,而在海马的颗粒细胞层和锥体细胞层神经元中p S133-CREB表达水平明显降低。在Aβ42注射7天组,p S133-CREB的表达与对照组比无显著差异。6.侧脑室注射Aβ42在急性期降低神经元p S133-CREB表达水平侧脑室注射老化Aβ42后24 h,用Neu N和p S133-CREB进行免疫荧光共定位染色。发现与对照组比,Aβ42组Neu N阳性神经元中p S133-CREB表达水平在海马各亚区均明显降低。7.抑制小胶质细胞可降低Aβ42诱导的小胶质细胞p S133-CREB的表达水平升高并改善小鼠的学习记忆功能腹腔注射米诺环素抑制小鼠的小胶质细胞的活性,可降低Aβ42诱导的小胶质细胞CREB磷酸化,并降低炎症因子的表达和突触损伤,改善小鼠的学习记忆功能。8.Aβ42通过PKA依赖的CREB磷酸化途径激活小胶质细胞的炎症反应用老化的Aβ42处理小胶质细胞Bv2,可见PKA活性增强,CREB的Ser133位点磷酸化水平增高,同时伴有炎症因子IL-6的分泌增加和金属蛋白酶MMP-9的转录水平增加;同时用PKA抑制剂H89 2HCl抑制CREB磷酸化可将降低IL-6的分泌和MMP-9的转录。9.Aβ42通过小胶质细胞导致损伤神经元用老化Aβ42处理过的Bv2细胞培养基处理原代海马神经元,可导致神经元突触相关蛋白表达降低;而同时用H89 2HCl抑制Bv2细胞的CREB磷酸化可恢复突触相关蛋白的表达。HVCN1(voltage-gated proton channels,VSOP/Hv1)是一种表达在免疫细胞的电压门控质子通道,在中枢神经系统,则主要表达在小胶质细胞,参与活性氧形成,免疫吞噬反应。有研究发现HVCN1或许是脑缺血损伤的一个治疗靶点,因为敲除HVCN1可以减轻小胶质细胞产生活性氧(ROS),避免神经元受损。阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种多因素的慢性神经退行性疾病,氧化应激和炎症反应也被认为是其发病机制之一,我们的研究发现在氧化应激动物模型中,HVCN1的表达升高并伴随着AD两大病理蛋白的升高,分别是tau的磷酸化和Aβ42/Aβ40的比值。在Aβ相关的AD模型中,也存在着HVCN1的升高,并聚集在磷酸化的tau周围,这提示我们HVCN1在AD的病理过程中或许发挥着作用。