第一部分p H和还原程序性响应修饰的可降解树枝状分子聚合物用于肝癌的基因治疗研究背景micro RNA(mi RNA)疗法为治疗晚期恶性肿瘤提供了很好的思路,但受限于mi RNA的不稳定性和易脱靶性,治疗效果却仍然不尽如人意。micro RNA-122(mi R-122),是一种在正常肝组织中含量丰富的micro RNA,有研究表明其含量在肝癌细胞中被大大下调促进了肝脏癌变和肿瘤生长,通过递送mi R-122进入肿瘤部位可以抑制肿瘤的生长。但是mi R-122治疗肝癌需要在病灶精确释放,以减脱靶效应增加肿瘤内的mi R-122剂量。树枝状分子聚合物因其表面丰富的正电荷,一直是广泛研究的热门基因载体,但是存在转染效率越好毒性也越大的问题,和本身过高的正电荷导致在循环过程容易被清除等问题。通过引入肿瘤微环境程序响应的功能性树枝状聚合物,可以提高mi R-122在血液循环中的稳定性,并增加其在肿瘤部位的富集,进而增强对肝癌的疗效。实验目的本研究的目的是为了合成新型的p H和还原程序性响应修饰的可降解树枝状分子聚合物,并将其用于改善肝癌的基因治疗。材料与方法通过含有二硫键的3,3’-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)与二代PAMAM(G2)摩尔比1:1反应生成GSSG。继续将GSSG与与末端含有p H响应Dlinkm的PEG(MW=5000 Da)以摩尔比G2:PEG摩尔比1:1反应生成目标化合物BOMB。通过1H NMR和傅里叶变换红外光谱FT-IR表征化合物机构,凝胶电泳实验确认载mi R-122的能力,动态光散射(DLS)实验和透射电镜(TEM)检测和观测BOMB/mi R-122系统的粒径和形貌。体外模拟肿瘤微环境,研究BOMB系统的mi R-122释放性外,以人源肝癌Huh-7细胞为模型,体外实验验证BOMB系统的吞噬能力,以及通过RT-q PCR实验测试BOMB/mi R-122系统处理后肝癌细胞mi R-122表达水平,另外还通过WB实验测试对mi R-122靶标蛋白表达的影响情况。同时我们以Huh-7细胞荷瘤裸鼠为模型,验证BOMB系统的体内抑瘤能力。结果我们顺利合成了BOMB高分子材料,核磁共振氢谱和红外光谱验证了材料的合成。实验结果还表明BOMB有很好的绑定mi R-122的能力,形成的BOMB/mi R-122粒子大小为200 nm左右且呈球形。BOMB/mi R-122在模拟肝癌低p H的微环境下,纳米粒子粒径变小电荷变高易于被肝癌细胞吞噬,同样的也表现出了很好的基因转染能力。当逐步给与BOMB/mi R-122系统低p H刺激和还原刺激,mi R-122的释放呈现明显的刺激依赖性,同时存在p H刺激和还原刺激时mi R-122快速释放。活体荧光结果表明,BOMB/mi R-122系统不仅有很好的长循环能力,也具备很好的肿瘤靶向性。与裸mi R-122基因治疗相比,BOMB/mi R-122抑制肿瘤的效率大大增强,免疫组化和western bloting实验也表明BOMB/mi R-122治疗组的肝癌细胞mi R-122靶标蛋白被大大下调。结论BOMB系统合成简单精巧,可以程序性的对肿瘤微环境做出响应,使得mi R-122可以靶向可控的在肿瘤部位释放,进而增强了肝癌的精准治疗效果,具有很大的应用前景。第二部分还原响应PEG修饰新型树枝状大分子介导胰腺癌分子靶向治疗并克服耐药的研究背景胰腺癌是致死率极高的恶性肿瘤,传统化疗对其疗效不佳。有研究发现m TOR抑制剂可以有效的抑制胰腺癌的发生和生长,其中OSI-027可以同时抑制m TOR的m TORC1和m TORC2两个复合物,为胰腺癌治疗提供了新的选择。但是OSI-027和绝大多数的分子靶向药物一样存在:(1)水溶性较差,不能达到有效治疗浓度;(2)不能有效到达肿瘤部位;(3)治疗过程中会产生耐药等问题。树枝状分子载体具有疏水的空腔和亲水的外壳,是常用于运载疏水药物的载体。还原响应性修饰后,可以在肿瘤细胞的还原环境下特异性裂解,用于包载OSI-027既可以提高药物溶解度以改善其给药方式,还可以提高OSI-027的肿瘤靶向性,另外也有文献表明纳米材料的引入有克服肿瘤耐药的可能性。实验目的本研究拟研制一种新型还原响应性修饰的树枝状纳米载体,用于提升OSI-027的水溶性、肿瘤部位的靶向性,进而提高胰腺癌和耐药胰腺癌的的分子靶向治疗效果。材料与方法本研究使用嵌入还原响应性二硫键的八臂PEG偶联树枝状分子PAMAM[二代(p G2)、三代(p G3)],和自主合成的树枝状分子Dendrimer[二代(m G2)、三代(m G3)]构建一系列还原性修饰的树枝状分子聚合物。通过1H NMR表征产物图谱,紫外分光光度计检测材料的载药率,并使用ATUO DUCK软件模拟计算材料和OSI-0217的相互作用力,选取载药率最高的纳米材料。通过动态光散射法DLS和透射电镜观测载体系统的粒径和形貌。用药物诱导法诱导耐药胰腺癌细胞,通过细胞吞噬,细胞转染、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观测细胞对载药系统的吞噬和转染能力。体内实验部分,构建正常细胞荷瘤小鼠和耐药细胞荷瘤小鼠,通过活体荧光实验监测携带Cy5的材料在各个部位的荧光强度,评估材料的肿瘤靶向能力;给药后定期测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线,评估抑瘤能力。我们还通过转录组测序分析,探究载药系统克服耐药性的机制。结果我们的研究结果表明,在引入MAP-m G3递送系统后,非水溶性靶向药物OSI-027的溶解度得到增强,可以通过静脉给药规避首过效应。活体荧光实验显示载体系统在肿瘤部位有很好的富集作用,并且通过检测胞内药物浓度证实载体的引入可以大大增强药物的被吞噬量,体外实验证明MAP-m G3/OSI-027对于正常和耐药胰腺癌细胞均有更高的抑制效果。体内实验进一步证明,MAP-m G3/OSI-027对正常细胞荷瘤模型和耐药胰腺癌细胞荷瘤模型均有出色的抑瘤作用,即使降低给药量的一半,也比口服给药有更好的疗效。转录组测序结果推测耐药基因ABCB1是细胞产生耐药的主要原因。结论综上,MAP-m G3可以大大增强OSI-027的水溶性,以用于静脉方式给药。MAP-m G3/OSI-027载药系统具有很好的体外体内抑瘤作用,且能克服胰腺癌的耐药。可被进一步改造为未来生物医学中,应用于针对恶性肿瘤的潜在安全和有效的递送系统。