因近年来干细胞研究的重大进展及应用材料的完善和发展,利用血管组织工程方法构建良好血管替代物已成为极具临床应用前景的研究热点。种子细胞的获取、培养和在支架上的生长是组织工程血管研究的关键性环节。血管壁从管腔面向外一般依次为内膜、中膜和外膜。内膜主要由内皮细胞组成,内皮前体细胞作为新型的、良好的种子细胞来源,已被广泛接受。而平滑肌细胞作为主要的中膜细胞,是组织工程血管中发挥收缩舒张血管、分泌蛋白、参与合成细胞外基质等功能的种子细胞,目前的来源主要是成熟细胞。然而成熟平滑肌细胞易衰老,来源有限,且为获取会造成血管创伤性损害,成为构建组织工程血管的瓶颈问题。本实验尝试从大鼠外周血中分离出单个核细胞,将其分化到平滑肌细胞,并种植在高分子合成材料和生物材料的支架上,初步探索已分化的平滑肌细胞在组织工程血管中的应用。本实验以密度梯度离心法分离SD大鼠外周血中的单个核细胞,用含PDGF-bb的EGM-2-MV培养液将其诱导分化到平滑肌细胞;从细胞形态和平滑肌细胞特异性标志物的检测两方面对分化的细胞加以鉴定。将前体细胞分化而来的平滑肌细胞以2×10~5/cm~2的密度分别种于有丝素修饰或无丝素修饰的高分子材料PHBHHx制成的支架,培养三周以上的时间,以MTT和扫描电镜的方法观察其生长情况。将均由前体细胞分化而来的平滑肌细胞和内皮细胞以1:3—1:4的比例种植在Ⅰ型胶原凝胶上,一周后用免疫荧光染色的方法检测已分化的内皮细胞的生长情况。外周血单个核细胞中的平滑肌前体细胞经诱导三天后便出现“极性”,一周后呈现细长梭形,并且有生成集落的趋势。三周后,大量的细胞在光镜观察下呈现成熟平滑肌细胞典型的“波峰谷”形态。用平滑肌细胞培养液继续培养,细胞保持其形态,并可在半年内传代30代以上,增殖能力保持活跃。免疫荧光染色、RT-PCR和Western Blotting显示与收缩功能相关的平滑肌细胞的特异标志物—SMα-actin、SM MHC和Calponin为阳性。RT-PCR同时证明这些细胞表达与合成细胞因子和细胞外基质功能相关的平滑肌细胞特异性的mRNA,包括VEGF、弹性蛋白和基质Gla蛋白。这些标志物的存在初步证明了已分化的平滑肌细胞具备执行实体中血管平滑肌细胞功能的基础。在PHBHHx支架上种植的已分化的平滑肌细胞不但存活,而且代谢活跃,具有良好的增殖能力,并且证明丝素修饰的材料更适合已分化的平滑肌细胞的生长。与己分化的内皮细胞联合培养在Ⅰ型胶原凝胶上一周后,光镜下显示内皮细胞可以与平滑肌细胞互相混合,从平滑枷赴玫叫纬裳艿闹С?在体外较快形成管腔样结构。免疫荧光染色可见内皮细胞互相连接形成为微血管网络样结构。本研究为构建组织工程血管提供了一种新的种子细胞来源—外周血单个核细胞分化而来的平滑肌细胞。这些已分化的平滑肌细胞不但表达成熟平滑肌细胞的特异性标志物和功能分子,且来源无需造成血管创伤,细胞增殖能力强,在高分子材料支架和生物材料支架上也能保持其形态和活力,并能支持内皮细胞形成为微血管网络样结构。因此是一种新型的、良好的组织工程血管的种子细胞来源。