【摘 要】
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目的:基于前期的体外细胞实验:中药千金子抑制肾癌Renca细胞增殖有较好的药效学作用,利用现代分子生物学实验技术初步探讨千金子对小鼠肾癌Renca细胞形态、侵袭与转移、细胞周期以及凋亡的影响。以期为临床治疗肾癌研发新的中药治疗药物,提供实验依据和理论基础。方法:1.划痕实验法:将细胞接种于6孔板中,待细胞贴壁后,使用无血清培养基饥饿6h,用200μl的枪头垂直于6孔板划“1”字形的划痕,再用PBS
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目的:基于前期的体外细胞实验:中药千金子抑制肾癌Renca细胞增殖有较好的药效学作用,利用现代分子生物学实验技术初步探讨千金子对小鼠肾癌Renca细胞形态、侵袭与转移、细胞周期以及凋亡的影响。以期为临床治疗肾癌研发新的中药治疗药物,提供实验依据和理论基础。方法:1.划痕实验法:将细胞接种于6孔板中,待细胞贴壁后,使用无血清培养基饥饿6h,用200μl的枪头垂直于6孔板划“1”字形的划痕,再用PBS缓冲液冲洗2次。将千金子二萜醇用不含胎牛血清的培养基配置成最佳有效剂量9000μg/ml,实验组加入浓度为（9000μg/ml）的千金子二萜醇,以加入培养基组作为对照组。在划痕时开始和千金子处理24h后,在倒置显微镜下观测划痕的宽度并拍照;在显微镜下拍照并记录,千金子二萜醇对肾癌Renca细胞的影响。2.Transwell小室法:采用Transwwell小室法检测千金子二萜醇处理肾癌Renca细胞48h后穿过小室膜的细胞数,每次实验独立重复3次,通过数理统计分析方法分析实验所得结果。3.流式细胞技术（FCM）:检测千金子二萜醇对小鼠肾癌Renca细胞增殖周期以及诱导其凋亡的改变。将千金子二萜醇实验组和空白对照组分别处理24h后,收集单细胞,分别采用Annexin V-FITC法以及PI单染法检测细胞凋亡率和增殖周期的变化。并用Flow-Job软件分析其结果。4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法:检测肾癌细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达情况。将药物组和对照组分别培养48h后,收集细胞并提取总蛋白。采用免疫印迹技术检测Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达相对含量,实验结果用统计软件进行分析。结果:1.划痕实验结果:划痕实验中对照组肾癌细胞侵袭的距离为（0.72±0.03）mm,加入药物作用48h后,实验组肾癌细胞的侵袭距离为（0.62±0.03）mm,两组比较（P<0.05）具有统计学意义;与对照组相比较,千金子处理肾癌细胞24h以后,细胞变圆钝呈现出凋亡形态学的改变。2.Transwell小室实验结果:与空白对照组相比较,千金子二萜醇作用小鼠肾癌Renca细胞后,穿越小室膜的细胞数明显减少并且P<0.05,具有统计学意义。3.流式细胞结果:与空白对照组相比较（1）千金子二萜醇处理肾癌Renca细胞后,处于G0/G1期的细胞明显增多（P<0.05）处于S期、G2/M期的细胞降低。（2）千金子作用于肾癌Renca细胞后,无论早期凋亡率还是晚期凋亡率与对照组相比较（P<0.05）均有所提高。4.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果:与对照组相比较,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达量明显增多、抗凋亡蛋白Bcl-2表达量减少。结论:1中药千金子能够抑制小鼠肾癌Renca细胞侵袭与转移,并对其细胞形态产生影响;2中药千金子抑制肾癌Renca细胞增殖的分子机制可能与阻止肾癌细胞分裂周期,诱导其凋亡有关;3中药千金子诱导小鼠肾癌Renca细胞凋亡的分子机制可能与影响其细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平相关。
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