目的:晚期恶性肿瘤的治疗主要以放疗、化疗和靶向治疗为主,多种方法综合治疗能够改善晚期肿瘤患者的总生存,提高患者生活质量,但总体获益有限。如今,免疫治疗,特别是免疫检查点抑制剂已经成为抗肿瘤治疗的热点和革新,为晚期肿瘤的治疗提供了新的方法。在免疫检查点通路中,程序性细胞死亡蛋白1（Programmed death-1,PD-1）及其配体（Programmed death-ligand-1,PD-L1）是其中的主要研究对象。两者之间的结合能够抑制T细胞的活化和功能,具有促进肿瘤免疫逃逸、进展和转移的重要作用。PD-1或PD-L1单克隆抗体可以通过阻断PD-1与PD-L1之间的连接来诱导抗肿瘤免疫应答。近年来,免疫检查点抑制剂等各种类型的免疫疗法已开展了众多临床试验,并被批准用于治疗多种晚期恶性肿瘤。总体而言,单药PD-1单抗治疗的有效率较低,仅为10%～25%,而现有疗效预测因子有限。因此,能够有效预测抗PD-1治疗疗效生物标志物的研究亟待开展。作为靶通路的关键因子,通过免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）检测在肿瘤组织中PD-L1的表达,仅在晚期肺癌一线应用帕博丽珠单抗治疗中可以作为疗效预测因子。然而,也有一些研究表明,PD-L1低表达或无PD-L1表达的肿瘤患者应用抗PD-1/PD-L1治疗获益与PD-L1高表达人群没有显著区别。此外,根据不同临床实验的结论,PD-L1阳性的截断值定为1%～50%,并没有达成统一的标准。因此,PD-L1不能成为稳定的免疫治疗疗效预测指标。究其原因,主要是由于PD-L1表达形式的多样性以及免疫微环境的复杂性。一方面,PD-L1有多种表现形式。现有研究主要将PD-L1表达分为膜表面型PD-L1、可溶型PD-L1和外泌体型PD-L1（exosomal PD-L1）。外泌体（exosome）是一类直径在30～150nm,包含大量DNA、RNA、蛋白等生物物质的细胞外囊泡,因为其稳定性好、含量多、便于富集等优势成为液体活检的研究热点。与膜表面型和可溶型PD-L1相比,exosomal PD-L1更稳定且容易获取,成为免疫治疗疗效预测的潜在生物标志物。近期研究表明,exosomal PD-L1并不局限于肿瘤局部,而且可以在远处发挥其免疫抑制功能,能够抑制T细胞活化、抑制免疫记忆功能以及促进肿瘤生长。exosomal PD-L1还可以通过直接结合PD-L1抗体导致患者对免疫治疗的抵抗。Chen等人研究发现,基线exosomal PD-L1表达高的黑色素瘤患者应用PD-1单抗疗效更差,是由于在转移性黑色素瘤分泌的exosomal PD-L1抑制CD8+T细胞的活化并促进肿瘤生长。在头颈部鳞癌患者中,PD-L1高表达的外泌体能够显著抑制CD8+T细胞上的活化,这种抑制作用可以被PD-1抗体阻断。此外,抑制外泌体生成可以增强PD-1单抗的抗肿瘤作用。另外一些研究表明,PD-1抗体治疗后exosomal PD-L1显著升高的黑素瘤患者的治疗反应更差。另一方面,由于免疫系统的复杂性,单个指标不能完整全面地反映抗PD-1治疗的疗效和状态。肿瘤的特性、免疫细胞的功能以及免疫微环境的状态,三者在免疫治疗过程中紧密联系且相互影响。除了以PD-L1为代表的肿瘤细胞免疫抑制微环境外,还有众多的免疫抑制因子和免疫刺激因子参与调控免疫微环境。以PD-1、LAG-3和Tim-3为代表的T细胞的耗竭状态,以CD8和CD28为代表T细胞活化状态,还有INF-γ、颗粒酶B和穿孔素等表现T细胞杀伤功能的指标都可能对免疫治疗的疗效具有重要的预测价值。因此,本研究拟通过不同形式的PD-L1的检测、免疫治疗相关因子的联合检测以及生物信息学挖掘,来探讨不同形式的PD-L1对晚期肿瘤的预后和抗PD-1治疗疗效的预测价值,并且建立能够全面表征免疫微环境的基因模型,从而为晚期恶性肿瘤免疫治疗的疗效预测及潜在获益人群的筛选提供科学依据。材料与方法:1.分别纳入2012年12月-2015年12月在中国医科大学附属第一医院系统治疗的有病理学确认的不可手术切除治疗的或术后复发的晚期胃癌患者103例,以及2017年1月-2019年4月接受单药PD-1单抗治疗的有病理学确认的不可切除或术后复发的晚期恶性肿瘤患者44例。2.采用ELISA法检测exosomal PD-L1、exosomal PD-1和免疫相关因子。3.采用蛋白免疫印迹方法检测PD-L1、PD-1、CD9、CD63等蛋白的表达。4.采用流式细胞技术对exosomal PD-L1进行鉴定,检测exosomal PD-L1表达对T细胞凋亡、耗竭的影响情况。5.采用MILLIPLEX磁珠分析检测患者CD8+T细胞因子及肿瘤免疫相关因子水平。6.采用电镜、Nanosight技术检测血浆富集的外泌体。7.利用TCGA、GEO数据库下载肺鳞癌RNA测序表达数据集。8.应用ssGSEA的方法对数据集样本评分,应用WGCNA的方法聚类。9.统计学处理:应用SPSS 22.0统计软件进行卡方检验,Spearman秩相关检验和Fisher精确计算概率法。组间比较应用t检验,p<0.05有统计学意义。应用Cox模型进行单因素及多因素生存分析,LASSO Logistic回归进行分析结果的简化。结果:1、exosomal PD-L1对晚期胃癌患者预后影响:（1）生存分析显示晚期胃癌exosomal PD-L1高表达患者比低表达患者总生存期（overall survival,OS）更短（p=0.007）。（2）单因素分析显示exosomal PD-L1高表达为晚期胃癌患者OS的不良影响因素（HR=2.299,95%CI为1.232-4.291,p=0.009）。（3）多因素分析显示exosomal PD-L1高表达为晚期胃癌患者总生存的独立预后因素（HR=2.213,95%CI为1.183-4.137,p=0.013）。（4）验证集中验证exosomal PD-L1高表达晚期胃癌患者OS缩短（P=0.023）,时间依赖ROC（receiver operating characteristic）曲线提示其预测价值良好。（5）相关性分析显示exosomal PD-L1与CD4、CD8、CD3 T细胞计数成负相关（r=-0.318,p=0.026;r=-0.428,p=0.002;r=-0.436,p=0.002）,与刺激性因子IFN-γ表达成负相关（r=-0.407,p=0.004）,与抑制性因子IL-10、TGF-β表达成正相关（r=0.338,p=0.018;r=0.448,p=0.001）。（6）exosomes作用于活化的T细胞后出现凋亡增加（P=0.0104）,而应用过表达PD-L1的胃癌细胞分泌的exosomes作用于活化T细胞后,凋亡进一步促进（P=0.0002）。（7）exosomal PD-L1表达与耗竭型T细胞比例成正相关,并且耗竭型T细胞比例高的患者应用PD-1单抗治疗疗效不佳。2、exosomal PD-L1联合CD28预测晚期恶性肿瘤患者抗PD-1治疗疗效:（1）exosomal PD-L1和exosomal PD-1在PD-1单抗治疗无效组的患者中明显表达更高（p值分别为0.010和0.022）。（2）患者基线CD28、CD80、CD86、GITRL、ICOS和TLR-2的表达在PD-1单抗治疗有效组中更高（p值分别为0.005、0.019、0.038、0.024、0.009和0.008）。（3）X-tile选取最佳截断值,exosomal PD-L1高表达组的抗PD-1治疗无进展生存期更短（P=0.001）,CD28、CD80、CD86、GITRL、ICOS和TLR-2高表达组的抗PD-1治疗无进展生存期更长（p值分别为0.005、0.048、0.017、0.017、0.045和0.007）。（4）单因素分析显示exosomal PD-L1高表达为无进展生存期的不良因素（HR=3.017,95%CI为1.439-6.325,p=0.003）,而CD28高表达与无进展生存期延长有关（HR=0.394,95%CI为0.192-0.811,p=0.011）。此外,CD86、GITRL和TLR-2高表达也与无进展生存期延长有关(HR_CD86=0.409,95%CI为0.182-0.915,p=0.030;HR_GITRL=0.409,95%CI为0.182-0.915,p=0.030;HR_TLR-2=0.348,95%CI为0.149-0.812,p=0.015)。（5）多因素分析显示exosomal PD-L1为患者抗PD-1治疗疗效不佳的独立预测因素（HR=2.746,95%CI为1.627-8.480,p=0.009）。CD28为患者抗PD-1治疗有效的独立预测因素（HR=0.430,95%CI为0.206-0.897,p=0.025）。（6）在亚组分析中,非小细胞肺癌组exosomal PD-L1低表达和CD28高表达都显示出显著的无进展生存期延长（p值分别为0.010和0.045）。而在其他肿瘤组中,CD28高表达显示出无进展生存期延长（p=0.045）,exosomal PD-L1高表达也具有无进展生存期减少的趋势（p=0.066）。（7）利用ROC曲线评价预测效率,exosomal PD-L1与CD28两指标联合（曲线下面积,area under the curve,AUC=0.850）比单一指标效率更高(AUC_{exosomal PD-L1}=0.678,AUC_CD28=0.784)。（8）两指标阳性患者具有更长的无进展生存期（p=0.003）,并且应用PD-1单抗治疗有效率显著高于单一指标或无指标阳性的患者（p<0.0001）,在非小细胞肺癌和其他癌种中得到验证（p值分别为0.002和0.006）。3、生物信息学建立肺鳞癌中免疫炎症型基因模型及免疫治疗疗效预测:（1）应用ssGSEA评分和WGCNA方法,从TCGA、GSE50081肺鳞癌数据集中筛选免疫相关模块。（2）免疫相关模块功能富集与免疫细胞的功能相关,TCGA免疫相关模块基因与肿瘤炎症型成显著正相关（r=0.69,p<1e-200;r=0.93,p<1e-200;r=0.57,p=3.5e-135）。（3）利用TCGA、GSE50081所筛选的免疫相关模块,确定hub基因并取交集得到51基因,与肿瘤炎症型成显著正相关（r=0.38,p=1.1e-18;r=0.92,p=4.4e-200;r=0.32,p=5.4e-13）。（4）外部数据集验证,51基因在免疫炎症型患者中高表达（p=2.5e-6和p=7.5e-14）,在PD-L1单抗治疗有效组中高表达（p=0.031）。（5）LASSO简化后的7基因模型在免疫炎症型患者中显著高表达（p=1.7e-6和p=7.7e-14）,在PD-L1单抗治疗有效组中高表达（p=0.026）。（6）经过多种阈值的比较筛选,每种基因阳性表达的阈值定为第70百分位数,7基因模型中至少四个基因阳性,可以代表模型的阳性。（7）在肺鳞癌TCGA数据中,7基因模型阳性患者的肿瘤炎症型代表分子（IFN-γ、DC和PD-L1）表达更高（p=3.7e-16,p<2.2e-16,p=6.4e-10）。结论:1.exosomal PD-L1是晚期胃癌的独立预后因素,通过促进T细胞凋亡和耗竭,影响T细胞的数量和功能,IL-10、TGF-β释放增多,IFN-γ释放减少,导致晚期胃癌的预后不良。2.晚期肿瘤患者基线exosomal PD-L1联合CD28能够作为应用PD-1单抗治疗的疗效预测生物标记物,exosomal PD-L1作用的发挥可能与T细胞活化状态相关。3.通过生物信息学方法得到能够反映肺鳞癌免疫炎症型的7基因模型,能筛选出免疫抑制剂潜在获益的肺鳞癌患者。