三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国南方的一种重要淡水珍珠蚌类之一,同时也是一类水生环境监测和湖泊生态修复生物,由于其对环境污染物的高度积累和耐受性,给水生生态系统和人类健康带来了潜在的风险,因此对其免疫防御和免疫毒性相关分子的研究具有重要意义。本文构建了三角帆蚌肝胰腺差减cDNA文库,克隆了三角帆蚌肽聚糖识别蛋白(PGRPs)和谷胱甘肽S转移酶(GSTs)两种基因,并对其基因特性、表达模式和功能特征进行了研究。通过抑制差减杂交技术构建了三角帆蚌肝胰腺差减cDNA文库,对筛选的将近400个克隆进行序列测定,通过生物学信息分析发现其中98个差异表达明显。这些基因包括细胞凋亡相关蛋白、细胞骨架重构相关蛋白、胞内信号传导相关基因、免疫防御相关蛋白、细胞物质和能量代谢相关蛋白、翻译和转录相关因子等。研究结果大大丰富了蚌类基因组数据,同时首次获得了蚌类应对MC-LR毒性效应的基本数据。三角帆蚌肽聚糖识别蛋白(HcPGRPS1)的cDNA序列全长1137bp,包含708bp的开放阅读框,编码235个氨基酸。氨基酸序列同源性比对发现HcPGRPS1在C端有一个保守的PGRP结构域以及酰胺酶活性所需的一些保守位点。系统进化树分析表明HcPGRPS1与太平洋牡蛎CgPGRPS3的亲缘关系最近。荧光定量PCR显示,HcPGRPS1在三角帆蚌的组织中呈组成型表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为性腺和肠。LPS刺激后HcPGRPS1在肾脏、性腺、鳃和肌肉中表达显著性上调,PGN刺激后HcPGRPS1在肾脏和性腺中的表达显著性上调。在Zn2+存在的情况下pET21a-HcPGRPS1重组蛋白对金黄色葡萄球菌来源的Lys-肽聚糖和枯草芽孢杆菌来源的DAP-肽聚糖均具有结合活性和酰胺酶活性,并且对革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性菌的大肠杆菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌这四种细菌都具有抑菌活性。这些结果表明HcPGRPS1在贝类抵抗和防御病原微生物入侵的先天免疫系统中发挥着重要功能。三角帆蚌肽聚糖识别蛋白(HcPGRPS2)的cDNA序列全长973bp,包含657bp的开放阅读框,编码218个氨基酸。此外,还克隆获得HcPGRPS2的1个剪接异构体,全长537bp,编码151个氨基酸。氨基酸序列同源性比对发现HcPGRPS2在C端有一个保守的PGRP结构域以及酰胺酶活性所需的一些保守位点。系统进化树分析表明HcPGRPS2与夏威夷短尾鱿鱼EsPGRP4的亲缘关系最近。荧光定量PCR和免疫印迹分析显示,HcPGRPS2在三角帆蚌的组织中呈组成型表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为肠。LPS刺激后HcPGRPS2在肌肉和肝胰腺中表达显著性上调,PGN刺激后HcPGRPS1在肝胰腺、鳃和性腺中表达显著性上调。三角帆蚌谷胱甘肽S转移酶(HcGSTS)的cDNA序列全长996bp,包含612bp的开放阅读框,编码203个氨基酸,预测蛋白分子量为23.3kDa,理论等电点为5.46,其与菲律宾蛤仔HpGSTS1的相似性最高,为58%。序列分析显示HcGSTS不仅在N-末端含有高度保守的GSH结合位点,而且在C-末端含有相对多样化底物结合位点。多重序列比对分析和系统进化树分析表明HcGSTS属于GST基因家族中的sigma家族。荧光定量PCR显示,HcGSTS在三角帆蚌的组织中呈组成型表达,在肝胰腺中最高,其次为肾脏和性腺。LPS刺激后HcGSTS在肝胰腺、肾脏、性腺、鳃和肌肉中均出现显著性上调表达,PGN刺激后HcGSTS在肝胰腺、性腺、肾脏和肌肉中均出现显著性上调表达,而在MC-LR刺激后HcGSTS只在肾脏和肌肉中有显著性上调表达。蛋白活性检测显示,原核重组蛋白pET32a-HcGSTS的活性为4.54±0.08μmol/min/mg。结果表明HcGSTS与细菌病原体入侵时的免疫反应和外源性毒性物质的解毒有关,提示其可作为生物受到环境污染胁迫的指示剂。