锰（Mn）是人体必需的微量元素,但过量锰具有神经毒性。大量研究证实过量锰暴露可损害运动功能出现类帕金森病症状。然而,过量锰暴露是否会影响Aβ水平并诱发阿尔茨海默病（AD）尚存争议。错误折叠的蛋白质异常聚集具有神经毒性,在神经退行性疾病的发生发展中起到关键的作用,而细胞自噬能够降解清除这类错误折叠的蛋白多聚体,阻滞和延缓AD在内的神经退行性疾病的发病和病理进程。过量锰是否引起神经细胞或脑组织的自噬功能障碍,进而导致动物脑组织中或神经细胞外Aβ水平增加,目前尚无直接证据。第一部分慢性锰暴露对小鼠认知,Aβ水平及自噬通路蛋白的影响目的:探讨慢性锰暴露对APP/PS1小鼠认知功能,脑内Aβ水平及自噬通路蛋白的影响。方法:将20只3月龄APP/PS1转基因雄性小鼠随机分成锰暴露组（APP/PS1-Mn）和对照组（APP/PS1-Control）,每组10只;同窝的20只3月龄野生型雄性小鼠也随机分为锰暴露组（WT-Mn）和对照组（WT-Control）,每组10只。锰暴露组(将MnCl₂·4H₂O按照21.60g/L的浓度溶于0.9%的生理盐水,以0.1mL/10g体重灌胃,折算成染毒浓度为Mn²⁺60mg/kg体重)和对照组（0.1mL0.9%生理盐水/10g体重灌胃）均按照5次/周,1次/天的频率灌胃。染锰4个月后采用Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆功能;酶联免疫吸附检测小鼠脑内、血清及脑脊液的Aβ_1-40、Aβ_1-42含量;实时荧光定量聚合酶链式反应检测脑组织LC3、Beclin1、P62 mRNA水平;免疫印迹检测海马和皮质的LC3、Beclin1、P62、及脑组织淀粉样前体蛋白（APP）水平;HE染色观察实验小鼠海马和皮质细胞的形态结构;免疫组化检测实验动物海马和皮质Aβ的免疫活性;免疫荧光观测实验动物海马和皮质老年斑。结果:1、染锰对小鼠认知功能的影响（1）APP/PS1-Control组小鼠在灌胃过程中死亡3只,WT-Control组小鼠在灌胃过程中死亡2只,染锰小鼠均未死亡。（2）染锰前各组小鼠体重无统计学差异（P>0.05）;染锰2个月及以前,各组小鼠体重差异不具有统计学意义（P>0.05）;染锰3个月及以后,染锰组体重均显著低于相应的对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。染锰4月时,染锰组APP/PS1小鼠和WT小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺的脏器系数与对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。（3）锰暴露4个月的APP/PS1及野生型小鼠的血清、血细胞、皮质、海马中锰含量均高于对应的对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）;染锰4月时,锰暴露组海马组织锰浓度比皮质组织高（P<0.05）。（4）锰暴露4个月后,在水迷宫测试的第2天至第4天野生型和APP/PS1小鼠染锰组逃避潜伏期均高于对照组（P<0.05）,APP/PS1对照组小鼠逃避潜伏期高于野生型对照组（P<0.05）,APP/PS1染锰组小鼠逃避潜伏期高于野生型对照组和野生型染锰组（P<0.05）;各组小鼠定向航行运动速度差异无统计学意义（P>0.05）;在空间探索实验中,APP/PS1和WT小鼠染锰组小鼠穿越平台次数均低于对照组（P<0.05）,APP/PS1小鼠染锰组小鼠在平台所在象限的时间低于对照组（P<0.05）;APP/PS1对照组小鼠和染锰组小鼠穿越平台的次数低于WT对照组（P<0.05）;与对照组相比,WT小鼠染锰后,其探索策略由直线式向趋向式改变;与对照组相比,APP/PS1小鼠染锰后,其探索策略由边缘式向随机式改变。2、染锰对小鼠脑内Aβ水平的影响（1）与对照组比较,染锰4月的APP/PS1转基因小鼠和WT小鼠海马和皮质APP蛋白均无明显改变（P>0.05）。（2）ELISA结果显示,与APP/PS1对照组相比,锰暴露4个月后APP/PS1染锰小鼠血清、脑脊液、海马、皮质中的Aβ_1-40、Aβ_1-42明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）;与WT对照组相比,WT染锰小鼠血清、海马、皮质中的Aβ_1-42及海马、皮质中的Aβ_1-40明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）,但血清、脑脊液中的Aβ_1-40与脑脊液中的Aβ_1-42未见明显改变（均P>0.05）;与WT对照组相比,锰暴露4个月后APP/PS1对照组和APP/PS1染锰组小鼠血清、海马、皮质中的Aβ_1-40及血清、脑脊液、海马、皮质中的Aβ_1-42明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）,但脑脊液中Aβ_1-40未见明显改变（P<0.05）。（3）免疫组化结果显示,与对照组小鼠相比,锰暴露4个月后APP/PS1和WT小鼠锰暴露组海马和皮质区Aβ免疫活性增高（P<0.05）。（4）免疫荧光结果显示,锰暴露4个月后APP/PS1小鼠锰暴露组海马和皮质老年斑的平均光密度值高于对照组（P<0.05）;WT小鼠染锰组和对照组的海马和皮质均未出现老年斑。3、染锰对小鼠脑内自噬通路蛋白的影响（1）与对照组相比,APP/PS1小鼠锰暴露组海马LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值降低,Beclin1蛋白降低,P62蛋白升高,差异均有统计学意义（均P<0.05）;与对照组相比,APP/PS1小鼠锰暴露组皮质LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值、Beclin1及P62蛋白水平均无明显变化（均P>0.05）;与对照组相比,WT小鼠锰暴露组海马及皮质的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值降低,P62蛋白升高,差异有统计学意义（均P<0.05）,Beclin1无明显变化（P>0.05）。（2）常规HE染色结果镜下可见WT和APP/PS1对照组小鼠海马锥体细胞层排列整齐,细胞体积较大,细胞核大而圆,核仁明显;WT和APP/PS1染锰小鼠海马锥体细胞稀疏、松散,层次不清,其中可见胞质浓染,胞体变小的细胞,及神经元变性受损征象;WT和APP/PS对照组小鼠大脑皮质神经元数量较多,神经元体积较大核圆,核仁明显,细胞轮廓清晰;WT和APP/PS1小鼠染锰后,皮质内神经元体积变小,出现零散的严重损伤细胞,主要表现为细胞核周及胞浆空泡变性细胞结构破坏以及细胞轮廓模糊。结论:慢性锰过量暴露可在脑内的海马和皮质聚积,损害APP/PS1和WT小鼠学习和记忆能力,导致海马、皮质的Aβ水平升高,并导致脑组织海马区自噬降解清除功能障碍。第二部分自噬在锰致N2a细胞Aβ水平变化中的作用目的:通过体外实验,在对N2a细胞自噬水平进行调控后进行染锰实验,探讨自噬在锰所致的Aβ水平变化中的作用。方法:CCK8检测不同锰浓度下细胞的存活率,计算出锰致N2a细胞的IC₅₀为550mm/L。为了保证锰处理N2a细胞的后有足够数量的细胞数量,利于后续实验的开展,把N2a细胞染锰实验分为四组:即空白对照组（无血清的培养基处理细胞）,低剂量染锰组（100μmol/L MnCl₂）,中剂量染锰组（200μmol/L MnCl₂）和高剂量染锰组（400μmol/L MnCl₂）。在调控自噬后的染锰实验中:实验组分为六个组,分别为空白对照组（无血清的培养基处理细胞）,锰处理组（400μmol/L MnCl₂）,雷帕霉素对照组（200nmol/L RAPA）,雷帕霉素+锰处理组（200nmol/L RAPA+400μmol/L MnCl₂）,3-MA对照组（10mmol/L 3-MA）,3-MA+锰处理组（10mmol/L 3-MA+400μmol/L MnCl₂）。酶联免疫吸附检测各组Aβ_1-40、Aβ_1-42的含量;免疫印迹检测各组N2a细胞的LC3、P62、及APP表达水平;电镜检测各组N2a细胞自噬小体;运用自噬激动剂雷帕霉素（RAPA）和抑制剂3-MA对染锰N2a细胞自噬进行调节,观察自噬对染锰N2a细胞清除Aβ的作用。结果:1、染锰实验:（1）在不同剂量的锰处理组之间,N2a细胞内APP蛋白水平的差异无统计学意义（P>0.05）。（2）N2a细胞经不同浓度的锰（0-400mm/L）作用24小时,细胞外液中Aβ_1-40和Aβ_1-42随染锰剂量增加呈现升高的趋势;当染锰剂量为400mm/L时,与空白对照组相比,细胞外液中Aβ_1-40和Aβ_1-42升高具有统计学意义（P<0.05）。（3）N2a细胞的自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I比值和P62蛋白表达量随锰浓度的增加而增加,并呈浓度依赖性（P<0.05）;与空白对照组相比,锰浓度为200mm/L及400mm/L组的自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I比值显著增加,400mm/L组的P62蛋白显著增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。（4）电镜发现,对照组细胞细胞核呈圆形,核膜清晰;线粒体数量丰富,自噬数量较多,溶酶体数量较少。锰浓度为100mm/L组细胞,细胞核呈不规则形,线粒体数量丰富,自噬数量较多;锰浓度为200mm/L组细胞,细胞核呈圆形,线粒体数量丰富,自噬数量较少,未见典型溶酶体。锰浓度为400mm/L组细胞,细胞核呈不规则形凹陷,线粒体数量丰富,自噬数量较多。2、自噬调控后的染锰实验:（1）与对照组相比,锰处理组LC3-II/LC3-I比值和P62水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;雷帕霉素处理组LC3-II/LC3-I比值降低,P62水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）;3-MA组LC3-II/LC3-I比值呈现增加趋势,但差异不具有统计学意义（P>0.05）,P62水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与锰处理组相比,雷帕霉素+锰处理组LC3-II/LC3-I比值降低,差异有统计学意义（P<0.05）,P62水平呈现降低趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;3-MA+锰处理组LC3-II/LC3-I比值升高,P62水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）用雷帕霉素增强细胞自噬,3-MA抑制细胞自噬,染锰24小时后N2a细胞内APP蛋白表达在各组间差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比,锰处理组细胞外液中Aβ_1-40和Aβ_1-42水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与锰处理组相比,雷帕霉素+锰处理组细胞外液中Aβ_1-40和Aβ_1-42水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与锰处理组相比,3-MA+锰处理组细胞外液中Aβ_1-42水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与空白对照组相比,雷帕霉素对照组和3-MA对照组细胞外液中Aβ_1-40和Aβ_1-42差异均无统计学意义（所有P>0.05）。结论:锰处理N2a细胞可导致细胞外液中Aβ水平升高,可能与锰导致N2a细胞自噬功能障碍,进而减少了Aβ的清除有关。