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中枢神经系统(central nervous system,CNS)易受损伤,并且成熟的CNS再生能力十分有限。然而,近来在成年哺乳动物脑内发现神经干细胞,增加了通过招募内源性神经干细胞的潜在再生能力可以修复缺损脑组织的可能性。本研究采用大脑皮层及海马CA1区的机械性损伤模型,确切造成认知功能障碍后,植入生物活性载体即壳聚糖与神经营养因子-3(NT-3)的复合物,观察其对内源性神经干细胞的激活情况,对损伤脑组织的修复作用,损伤后瘢痕形成的情况,并用水迷宫检测植入该生物活性载体后,对脑损伤后认知功能的改善作用。
成年Wistar大鼠108只,体重290-310g,随机分为以下四组:假损伤组(sham control):即只通过手术打开颅骨骨窗,27只； 单纯损伤组(lesioncontrol):通过手术打开颅骨骨窗且损伤大脑皮层,海马CA1区后,不施加任何干预措施,27只;单纯壳聚糖载体组:通过手术打开颅骨骨窗且损伤大脑皮层和海马CA1区后,立刻向损伤区移植入单纯的壳聚糖载体(即不结合NT-3的壳聚糖载体)(blank chitosan carriers,单纯壳聚糖),10mg壳聚糖载体/只大鼠,27只:NT-3-壳聚糖载体组(NT-3-chitosan carriers,NT-3-壳聚糖):通过手术打开颅骨骨窗且损伤大脑皮层和海马CA1区后,立刻向损伤区移植入NT-3-壳聚糖载体,10mgNT-3-壳聚糖载体/只大鼠,27只。术后3、7、10、15天灌杀动物,取脑进行连续冠状切片,OX-42染色观察移植物与宿主损伤区周围组织的融合情况；GFAP免疫组织化学染色检测损伤区边缘阳性细胞的数目,进行统计学分析,反映胶质瘢痕的形成情况；Nestin免疫组织化学染色检测损伤后内源性神经干细胞的激活情况；GAP-43、NF免疫组织化学染色显示损伤区内及移植物中神经纤维的生长情况；术后1月应用BDA-FITC神经示踪方法对神经通路重建进行评价,具体方法为在损伤区对侧对称位置注射BDA-FITC,24小时后灌杀动物,取脑进行连续冠状切片,荧光显微镜下观察示踪剂走行情况,术后3、7、15、30、60天灌杀动物,取脑做透射电镜观察损伤区内以及损伤区与周围正常组织所形成的突触联系。另外于术后11-15天,26-30天及56-60天采用Morris水迷宫的方法记录各组动物到达平台的逃避潜伏期,评价各组动物的认知行为的变化。
本实验研究结果显示:水迷宫实验中各时间点单纯损伤组与假损伤组动物的潜伏期存在明显差异,壳聚糖生物活性载体移植组及单纯壳聚糖移植组动物潜伏期与单纯损伤组有明显统计学差异,并且与假损伤组相比没有统计学意义；移植物与大鼠脑组织整合良好；移植组损伤区边缘GFAP阳性细胞计数与对照组相比有明显统计学意义；损伤后各组有Nestin阳性细胞的激活,但是移植组激活的Nestin阳性细胞数较多,且可以迁移进入损伤区内；术后1个月时NF免疫组化染色显示有神经纤维长入,并有NF阳性细胞及神经纤维出现于移植物内；由损伤对侧对称位置注射BDA-FITC进行神经束路追踪,在载体移植组的损伤区内发现被标记的神经元及神经纤维,术后2月透射电镜显示损伤区内有突触形成。由此本课题得出以下结论:本实验采取的创伤性脑损伤模型成功造成动物认知行为的障碍；壳聚糖生物活性载体移植的治疗方法能够改善创伤性脑损伤动物的认知功能障碍,减少损伤部位的瘢痕形成,并且能够激活内源性神经干细胞,诱导神经元迁移至损伤区,促进损伤区内神经纤维的生长,形成突触,最终导致了神经通路的重建。