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多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘性疾病,主要病理改变为大脑半球的侧脑室旁、脑于以及脊髓处髓鞘脱失,并有不同程度的炎性细胞浸润。现已普遍认为该病主要是由自身反应性T细胞所介导的针对CNS髓鞘自身抗原的自身免疫病,其中CD4+T细胞在MS中其关键作用,CD8+T细胞也有一定致病性。目前的免疫抑制药物都不能有效治愈MS,有时患者还会出现反应欠佳或不能耐受,严重影响了患者的生活质量。选择性清除或抑制同种反应性T细胞是治疗自身免疫病等的理想策略之一,因为它能避免免疫抑制剂所导致的患者整体免疫功能损伤。因此,几十年来人们一直在探索各种特异性免疫疗法,杀伤性人工抗原提呈细胞(Killer artificial antigen-presenting cell,KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使现有的抗原提呈细胞表面表达Fas配体,并通过细胞膜上的pMHC分子靶向结合抗原特异性T细胞,同时通过膜上的FasL与活化后T细胞膜上的Fas分子结合从而诱导T细胞凋亡这种策略对同种移植排斥、自身免疫病及变态反应等的治疗都有很多成功的报道。近年来人们开始使用非细胞性载体,如磁珠、胶乳微球等制备KaAPC.其基本原理是以pMHC多聚体为靶向抗原,与anti-Fas共包被细胞大小的磁珠或胶乳微球,在体外靶向杀伤抗原特异T细胞。本课题组前期利用可在人体内生物降解、无毒性、有组织相容性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)微球制备 KaAPC,在体外和皮肤移植鼠体内成功实施了抗原特异性T细胞的靶向杀伤,有效延缓同种皮肤移植物的成活期。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是研究多发性硬化的理想动物模型。本研究利用PLGA微球共吸附以装载有MOG两种抗原表位的H-2Db/MOG40-54二聚体和H-2I-Ab/MOG35-55多聚体,同时共价偶联三种T细胞反应的负调节分子(anti-Fas mAb.PD-L1-Ig.TGF-β1)和抗吞噬分子(CD47-Ig),制备多功能的新型KaAPCs,初步研究其治疗小鼠EAE的效果。主要结果如下：1)用21只6-8周雌性C57BL/6小鼠,随机分为3组,即PBS组、BCG组和MOG组,9只/组。将MOG35-55多肽与完全弗氏佐剂CFA等体积混合后充分乳化(BCG最终浓度10mg/ml),皮下多点注射MOG组小鼠(MOG400μg/0.2ml/只);PBS组和BCG组则分别用PBS和BCG代替MOG多肽,同样行皮下多点注射。同时,在第0天,BCG组和MOG组每只小鼠经腹腔注射0.2mlPTX(500ng/只),并在48小时后重复注射一次。结果显示,MOG组所有小鼠从造模第7天后陆续发病,至第11天为发病初期,第18天为发病高峰,至第40天为慢性期；HE染色显示脑和脊髓多区域炎性细胞在发病初期明显增加,高峰期最多；免疫组化显示MBP蛋白从发病初期即开始减少,至发病高峰期最少;GFAP蛋白则相反,发病初期阳性细胞增多,高峰期最多,慢性期趋于平稳；流式检测显示：淋巴结中MOG35-55特异性CD4+T细胞频率和MOG40-54特异性CD8+T细胞频率在发病初期增高,高峰期最高,慢性期次之；ELISPOT显示：脾细胞群中对MOG35-55和MOG40-54多肽刺激有反应活性的T细胞频率在发病初期最高,高峰期次之,慢性期最低,与病程中特异性CD4+T和CD8+T的数量水平不一致。2)利用双乳化剂挥发法成功制备了表面功能化的、直径4.5μm的PLGA微球。扫描电镜、Zeta电位和粒径分析显示其具有良好的表征：呈规则球形,表面完整,62.2%的微球直径在4.0-5.0μm,平均Zeta(ζ-)电位为36.3mV±6.11mV,分散性好,表面氨基基团丰富；单抗染色和流式分析证实：所制备的KaAPCs成功共展示了相应的H-2Db-lg二聚体和H-21-Ab-lg多聚体、anti-Fas及其他分子,微球表面的分子表型正确。3)将制备好的KaAPCs输注治疗小鼠EAE模型,在发病的第11天,第14天和第17天分别给予KaAPCs尾静脉注射,每次1×107 PLGA/ml/只。初步临床观察和神经功能评分显示：KaAPCs治疗组小鼠在第三次治疗后开始出现明显的临床缓解症状,其他PBS治疗组、空白PLGA治疗组和无关抗原肽特异性KaAPCs治疗组均未出现症状减轻迹象,初步提示KaAPCs治疗EAE的有效性。结论：成功制备EAE小鼠模型,并动态分析了病理指标和抗原特异性T细胞数量和反应活性的变化规律；成功制备PLGA微球式杀伤性人工抗原提呈细胞,并在治疗EAE模型中初步显示了有效性。