周围神经损伤因可能造成机体感觉和运动功能的部分或全部丧失,从而严重影响机体的功能行使和生活质量,其修复再生一直备受关注。利用组织工程学的原理和方法制备人工神经以修复周围神经缺损是这一研究领域的热点。本课题正是基于此欲构建一种新型的组织工程化神经移植物并对其生物学性能进行评价,为获得可桥接周围神经缺损并可促进周围神经再生以及功能恢复的生物性神经移植物做一临床前研究。第一部分Myroilysin脱细胞异种神经支架的制备与结构观察目的：制备一种新型脱细胞异种神经支架并对其进行结构观察。方法：获取新西兰大白兔坐骨神经后,分别利用经典是Sondell化学法和新型Myroilysin酶对其进行脱细胞处理,大体观察并制作组织切片经HE染色、Masson染色后光学显微镜下观察脱细胞神经支架的脱细胞效果、所保留神经基底膜结构以及胶原结构,制作电镜标本通过扫描电镜观察不同方法制备的神经支架的表面物理性状。结果：经Sondell化学法处理的神经直径基本无变化或稍小于天然神经,但经Myroilysin酶法处理的神经有膨胀现象并且更为透明。组织学观察,Myroilysin脱细胞神经获得了与经典Sondell化学法一致的结果,细胞、轴突、髓鞘结构消失,神经基底膜呈波浪状,胶原纤维排列均匀有序。扫描电镜结果显示Myroilysin酶法比化学法获得的神经支架结构呈现更为明显的纵形沟壑状。结论：Myroilysin酶法作为一种新型的脱细胞神经支架制备方法,与sondell具有类似的脱细胞效果,并且利用该方法制备的神经支架同样保留有均匀一致的基底膜结构。但Myroilysin脱细胞神经支架更为明显的纵形沟壑状结构可能对种子细胞的生长有“地形诱导”作用,是值得考虑的一种神经支架材料。第二部分人牙髓前体细胞的培养以及与神经组织细胞相关的蛋白表达目的：培养牙髓前体细胞并初步鉴定,探讨其作为组织工程化神经移植物种子细胞的可行性。方法：获取临床就诊的15-18岁患者中因正畸需要拔除并且牙根尚未完全发育完成的第三恒磨牙牙髓组织。按照Gronthos酶消化法进行原代培养,获得牙髓细胞,并进行传代,对其第三代细胞进行免疫荧光染色,鉴定间充质干细胞标记STRO-1和周围神经雪旺细胞标记S-100。结果：获得了能够高度增殖的细胞,免疫荧光结果显示所培养的细胞中存在STRO-1阳性的细胞,同时也存在S-100阳性的细胞。结论：本研究所获得的细胞中存在牙髓前体细胞,并且存在与某些神经细胞功能相似的细胞,将S-100阳性的牙髓前体细胞作为周围神经组织工程的种子细胞以获得更具神经营养功能的神经移植物具有一定的可行性。第三部分Myroilysin脱细胞异种神经支架的生物学性能目的：评价Myroilysin脱细胞异种神经支架的生物学性能,探讨牙髓前体细胞与该神经支架的生物适合性,为将来构建用于临床使用的新型人工神经提供理论依据。方法：制备脱细胞神经支架浸提液,与牙髓前体细胞共培养,通过CCK-8细胞增殖试验评价该支架的细胞相容性；将脱细胞异种神经支架植入Wistar大鼠皮下,术后分别在1周和4周取材,制作组织切片镜下观察支架与周围组织的反应以评价其组织相容性。利用Ⅰ型胶原酶酶解天然神经和Myroilysin脱细胞神经,比较二者的胶原稳定性,从而评价其降解情况。将人牙髓前体细胞植入Myroilysin脱细胞神经支架,通过EdU试验,观察细胞在支架上生长的排列模式。将牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞神经浸提液共培养,通过实时荧光PCR相对定量分析支架浸提液对牙髓前体细胞表达神经营养因子NGF和BDNF在mRNA水平的影响。结果：牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞神经浸提液共培养4天至6天后,其增殖活性高于其单独培养,表现出良好的细胞相容性；该支架材料植入大鼠背部皮下后,虽在植入早期出现急性炎症,但随即呈现组织修复过程,未出现不良反应,具有良好的组织相容性。Myroilysin脱细胞异种神经支架的降解速率与天然神经基本一致。Myroilysin脱细胞异种神经支架可使牙髓前体细胞粘附其上并呈现较为明显的方向性生长方式。牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞异种神经支架浸提液共培养后,神经营养因子NGF和BDNF在mRNA水平出现了上调。结论：Myroilysin脱细胞异种神经支架具有良好的生物相容性和体外降解速率,其多孔的纵形沟壑状结构可发挥“地形诱导”作用,同时其保留较好的周围神经细胞外基质成分具有一定的生物学诱导,可使牙髓前体细胞粘附其上并呈现较为明显的方向性生长,并可促进牙髓前体细胞对神经营养因子NGF和BDNF的表达。牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞异种神经支架这一细胞外基质之间具有良好的适合性,可能成为组织工程化神经移植物的新选择之一。