自噬是真核生物细胞内大分子物质降解的主要途径之一,是一种高度保守且受到复杂机制调控的生命进程。哺乳动物自噬起始激酶Ulk1(unc-51 like autophagy activating kinase 1)是酵母自噬启动基因Atg1在哺乳动物中的两种同系物之一,也是AMP激活蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)的下游分子,参与哺乳动物自噬起始。同时,ULK1还是哺乳动物雷帕梅素靶蛋白(mTOR,mammalian target of rapamycin)信号通路的负调控因子。在人类细胞中,ULK1的表达水平直接关系着自噬的正常进行与否,并且,Ulk1还是肿瘤抑制因子p53的作用靶位点。本试验在原核表达系统大肠杆菌中诱导表达人ULK1蛋白,以获得纯化的重组蛋白ULK1。目的基因ULK1的获得是由聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)得到的;以质粒pET-28a-SUMO为表达载体,构建重组质粒并转化入大肠杆菌Transetta(DE3)Cell;以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定ULK1在大肠杆菌中的表达,并确定ULK1在大肠杆菌中的表达形式;通过使用BeaverBeads?His-tag Protein Purification磁珠(组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠)来纯化重组蛋白。通过对ULK1在大肠杆菌Transetta(DE3)中的最佳表达条件的研究,揭示了ULK1蛋白在大肠杆菌中的最佳表达时间为3 h,最佳诱导密度OD600为1.0,在IPTG浓度为0.6 mmol/L时,诱导表达的蛋白量最多。主要得到以下几个结论:1、pET-28a-SUMO表达载体不能高效诱导表达可溶性ULK1蛋白;2、ULK1蛋白在大肠杆菌中的表达是以包涵体的形式存在;3、未能获得纯化的ULK1蛋白;G-四联体(G4)是由富含鸟嘌呤的核苷酸链通过GG碱基对所形成的四链二级结构,广泛存在于基因组及端粒中,在维持基因组稳定和基因表达调控等方面具有重要作用。G4能够为某些解旋酶特异结合并解旋,从而维持正常的基因组代谢。在人宫颈癌细胞Hela中起主要G4解旋作用的解旋酶是G4R1。试验表明G4R1具有高度的G4-DNA和G4-RNA结合和解旋活性,并以此调控基因表达。然而对于G4R1在体内如何解旋G4结构和调控基因表达,及在细胞增殖中作用还尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)长约18~24 nt,是一类普遍存在于动物、植物和病毒中的稳定非编码可调控的RNA分子,能够识别并结合靶基因mRNA的3’非编码区(3’-untranslationalregion,3’UTR),通过与靶序列特异性结合,抑制或降解mRNA,继而实现对靶基因表达的负调控,参与调节细胞生长发育、分化和凋亡等生理过程。本试验使用常用的生物信息软件Target scan(www.target.org),Pictar pictar(mdc-berlin.de)和miRanda(www.microrna.org),预测结果显示多个miRNAs(miR-30a、mi R-150、miR-340及miR-200b/c)能与G4R1 3’-UTR保守部分配对。为了研究mi RNAs对Hela细胞中G4R1的表达调控,我们将G4R1 3-UTR克隆连接入pGK-Gluc载体,成功构建pGK-Gluc-G4R1-3’-UTR载体,然后将其与miRNAs(miR-30a、miR-150、miR-340及miR-200b/c)共转染入Hela细胞,进行Gluc荧光素酶活性检测,结果显示miRNAs可显著抑制转染pGK-Gluc-G4R1-3’-UTR的Hela细胞中Gulc荧光素酶活性。随后对G4R1 3’-UTR进行突变后,转染pGK-Gluc-G4R1-3’-UTR-30aM的Hela细胞中Gulc荧光素酶活性并未受影响,说明miR-30a是通过G4R1-3’-UTR实现对G4R1的调节。同时,用western blot检测的也显示相同的结果,miR-30a降低G4R1蛋白的表达水平,并且随着miR-30a的增加,其对G4R1蛋白的表达抑制也逐渐增强,进一步确认了miR-30a通过对G4R1基因3’UTR的结合起到抑制G4R1蛋白表达的作用。另外,本研究也证实miR-340和miR-200c也可以对G4R1起到相似的调控作用。但miR-150和miR-200b则对G4R1蛋白表达影响作用不明显。