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近年来,具有优异的生理生化功能的生物活性多肽(如大豆肽、玉米肽等),吸引了众多研究者的注意。燕麦作为世界八大主要粮食作物之一,含有丰富的人体所必需的氨基酸、矿物质及维生素,是一种很好的制备生物活性多肽的原料。燕麦多肽具有很强的抗氧化性和自由基清除、抗衰老、降血压等功能,可应用于人体保健和化妆品行业,但目前关于燕麦多肽的研究报道较少。在众多制备生物活性多肽的方法中,酶催化蛋白质水解是一种经济有效且工业上常用的方法,它具有反应条件温和、环境友好等优点。碱性蛋白酶常用于燕麦多肽的制备,但游离的碱性蛋白酶具有操作稳定性差和不能重复回收利用等缺点。针对上述问题,本文采用氨基修饰磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(amino-functionalized magntic nanoparticles immobilized alkaline protease,AFMNs-AP)催化燕麦麸皮水解制备燕麦多肽,并研究了其抗氧化性。(1)固定化碱性蛋白酶的制备及其酶学性质的研究首先,制备了固定化酶载体--氨基修饰磁性纳米颗粒(amino-functionalized magnetic nanoparticles,AFMNs),并采用透射电镜、红外光谱、X射线衍射、X射线光电子能谱和磁饱和强度对载体进行结构表征,表明AFMNs材料已成功制备,并具有很强的磁性。其次,采用交联法以AFMNs为载体固定化碱性蛋白酶。结果表明:在优化的固定化条件下(AFMNs与酶量的比值为250(w/v,mg/m L),戊二醛浓度为28.0 mmol/L,在25 oC交联4 h,200 r/min),酶活回收率为54.2%。本文以Na-苯甲酰-L-精氨酰胺盐酸盐(N-α-benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride,BAEE)为模型底物研究固定化酶和游离酶的酶学性质,AFMNs-AP和游离酶的最适温度分别为65 oC和60 oC;最适p H均为7.5;热稳定性和p H耐受性试验表明,与游离酶相比,AFMNs-AP的热稳定性提高、耐酸碱范围扩大。AFMNs-AP与游离酶的Vmax/Km值分别为37.0和33.3 min-1,提示碱性蛋白酶被固定化后,催化效率有一定的提高。并且,AFMNs-AP操作稳定性较好,其连续使用5个和10个批次后,仍保留79.9%和50.1%的酶活。(2)AFMNs-AP催化燕麦麸皮水解制备燕麦多肽的研究通过单因素、响应面的Plackett-Burman(PB)、Box-Behnken Design(BBD)试验设计对反应条件进行优化,得到最适酶量、最适底物浓度、最适温度、最适 p H、最适反应时间分别为0.62 U/m L、54 mg/m L、50 oC、7.5和2.25 h。在上述条件下制备得到的燕麦多肽的DPPH自由基清除率为82.3%。抗氧化性分析表明燕麦多肽清除DPPH自由基的IC50为2.63 mg/m L,清除羟基自由基的IC50为0.18mg/m L,Fe2+螯合的IC50为0.81 mg/m L。可见所制得的燕麦多肽具有很好的抗氧化性。(3)抗氧化性燕麦多肽的序列初探燕麦多肽通过葡聚糖Sephadex G-25凝胶过滤层析得到A、B两个组分,这两个组分清除DPPH自由基的IC50分别为1.10 mg/m L、1.35 mg/m L,与未经分离纯化的燕麦多肽(IC50 2.61 mg/m L)相比,其抗氧化性有一定的提高。用葡聚糖Sephadex G-15凝胶过滤层析进一步分离纯化组分A,得到三个组分A1、A2、A3,这三个组分清除DPPH自由基的IC50分别为0.20 mg/m L、0.28 mg/m L、0.30mg/m L,其抗氧化性不但均高于燕麦多肽组分A,且高于Vc。高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱联用技术分析表明,A1所含的多肽序列分别为(Ser-Gly-Trp)3、Leu-Val-Glu-Asp-Lys、Thr-Ser-Glu、Trp-Asn、Ile-His-Asn、Glu-Asp-Lys。本研究不仅提供了一种高效制备燕麦多肽的新方法,还有助于促进磁性纳米材料在固定化酶方面的应用,并奠定了研究燕麦多肽构效关系的基础。