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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种由多种因素诱导的血管慢性炎症疾病,在AS发生过程中,巨噬细胞吞噬脂质转变为泡沫细胞,泡沫细胞堆积形成脂质条纹,最后发展形成脂质斑块。斑块破裂后形成血栓堵塞血管,导致缺血性中风或心肌梗死,严重威胁人类健康。AS的发生发展过程中,脂质代谢紊乱是重要的环节。肝X受体(Liver X Receptor,LXR)激活后可诱导细胞释放腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP),且明显减少AS斑块的形成。但详细的分子机制尚不明确。Pannexin1是六聚体形成的膜通道蛋白,其开放后可允许小分子通过,ATP即可经由该通道释放。但Pannexin1通道是否参与巨噬细胞吞噬脂质,从而进一步转化为泡沫细胞未见报道。本研究检测了Pannexin1通道对LXR介导THP-1巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)作用,并初步对其分子机制进行了探讨。该研究为深入研究AS发生发展机制提供了新的思路。1.采用佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导人急性白血病单核细胞(THP-1)分化成为THP-1巨噬细胞,并经细胞形态学及CD14m RNA的表达的检测对细胞分化是否成功进行鉴定。2.采用RT-PCR检测THP-1巨噬细胞中Pannexin1的m RNA的表达。3.采用Western Blot技术检测LXR激动剂(GW3965)刺激前后THP-1巨噬细胞中LXRα和LXRβ的表达情况。4.采用荧光显微镜观察LXR激动剂(GW3965)介导THP-1巨噬细胞摄取Dil-ox-LDL。通过加入Pannexin1通道抑制剂(10Panx1)前后观察LXR激动剂(GW3965)介导THP-1巨噬细胞摄取Dil-ox-LDL的变化,使用图像分析软件(Image-pro plus v6.0)对荧光图片进行分析,计算出对应的细胞数,用以衡量细胞摄取Dil-ox-LDL量的变化情况。5.采用萤光素酶法以及RT-PCR技术检测应用Pannexin1通道抑制剂(10Panx1)前后GW3965刺激细胞释放ATP的变化情况以及ATP结合盒转运子A1(ATP-Binding Cassette Transporters A1,ABCA1)的表达。结果:1.THP-1细胞经160n M PMA诱导分化24小时后,细胞形态由分化前的圆形悬浮生长变为梭型,并有大量的伪足出现,且呈贴壁生长。RT-PCR检测结果显示,THP-1经诱导分化为THP-1巨噬细胞后,THP-1巨噬细胞中CD14 m RNA表达水平明显上调,与THP-1细胞诱导前相比有显著性差异(p<0.001)。2.Western Blot检测显示LXR激动剂(GW3965)可以明显诱导THP-1巨噬细胞LXRα和LXRβ的表达。使用GW3965处理THP-1巨噬细胞前后差异有统计学意义(p<0.001)。3.THP-1巨噬细胞摄取Dil-ox-LDL结果显示:以Pannexin1通道抑制剂10Panx1(200μM)预处理细胞30分钟,再用GW3965刺激THP-1巨噬细胞4小时,结果发现抑制剂组可以减弱细胞对Dil-ox-LDL的摄取,与GW3965刺方法:激组相比有显著性差异(p<0.01)。4.THP-1巨噬细胞经GW3965刺激不同时间(0min、5min、10min、20min、30min)后,GW3965刺激组各时间点细胞释放的ATP含量较对照组显著增加(p<0.001),并且GW3965刺激10分钟时达到高峰;当使用200μM的Pannexin1通道特异性抑制(10Panx1)预处理细胞30分钟,检测结果显示ATP的释放量较GW3965刺激组明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。5.RT-PCR检测显示LXR激动剂(GW3965)可以诱导ABCA1的表达,当使用200μM的Pannexin1通道特异性抑制剂(10Panx1)预处理细胞30分钟,可明显地抑制GW3965诱导ABCA1的表达,差异有统计学意义(p<0.01)。结论:1.Pannexin1通道抑制剂(10Panx1)可抑制LXR激动剂(GW3965)介导的THP-1巨噬细胞释放ATP的过程。2.Pannexin1通道抑制剂(10Panx1)对LXR激动剂(GW3965)诱导巨噬细胞摄取ox-LDL的能力起到抑制作用。3.Pannexin1通道抑制剂(10Panx1)对LXR激动剂(GW3965)诱导巨噬细胞ABCA1的表达起到抑制作用