随着抗生素广泛使用,肠杆菌科多重耐药菌感染已成为医学治疗的严峻挑战。由于多粘菌素抗菌谱窄,且对其他抗生素耐药菌株敏感,因此常作为治疗肠杆菌科多重耐药菌感染的最后使用药物。不过,自我国学者发现编码可转移多粘菌素类耐药性基因mcr-1后,鉴于该基因可通过食物链和环境进行传播,人类治疗肠杆菌感染将面临十分严峻的处境。由于2002年至2016年6月间,我国曾一直将多粘菌素作为合法兽用生长促进剂或饲料添加剂使用,此外近年来陆续报道新型多粘菌素类耐药(MCR)基因,对动物/人源大肠杆菌携带MCR基因流行情况进行系统研究,分析该基因流行病学特征,挖掘其分子流行病学规律,对有效控制耐药基因传播扩散、耐药菌株防治和保证人类健康意义重大。本研究以分离自全国31个省(市、自治区)3663株大肠杆菌菌株(实验室原保存1962株,新分离鉴定1701株)为研究对象,其中动物源菌株3049株,人源菌株614株。采用PCR方法检测5种MCR基因(mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5)并计算其各自阳性率,进一步通过宿主、年代和地域三个方面系统分析MCR基因的分子流行病学特征;同时对携带MCR基因的菌株进行17种抗生素药物最低抑菌浓度(MIC)实验,确定MCR基因阳性菌株的多重耐药情况。结果表明,3663株大肠杆菌中,共有262株携带MCR基因,阳性率为7.2%(262/3663),其中 258 株携带 mcr-1基因,阳性率为 7.0%(258/3663),5株携带mcr-3基因,阳性率为0.1%(5/3663),1株菌同时携带mcr-1和mcr-3基因,没有检测到mcr-2、mcr-4和mcr-5基因阳性菌株。对上述菌株从宿主、年代和地域三方面分析MCR基因的分子流行病学特征。从宿主来源来看,猪源大肠杆菌的MCR基因阳性率(11.5%)明显高于其他宿主(鹅源8.0%;鸡源7.5%);从宿主畜禽分类来看,家畜动物来源MCR基因阳性率(9.9%)高于家禽(7.5%),动物源菌株阳性率明显高于人源菌株(仅1.5%);从年代变化来看,2009年-2013年,mcr-1基因阳性率有所提高,至2013年达到最高(16.8%);2014-2015年阳性率保持在16%左右;2016年-2019年,从15.4%下降至5.0%。从年代分析来看,mcr-1基因阳性率呈现先上升,再稳定,再迅速下降的趋势,表明与国家兽药使用政策密切相关。从地域分布来看,总体呈现东南部地区大于西北部地区的规律,其中华中地区的mcr-1阳性率(大于15%)最高,其次为东北地区、华东地区和华南地区,华北地区、西南地区和西北地区阳性率较低。从262株携带MCR基因的大肠杆菌对17种药物的MIC实验结果来看,所有菌株均呈现多重耐药,其中对多粘菌素的耐药范围为4 μg/mL至>64 μg/mL,MIC50和MIC90分别为8μg/mL和16 μg/mL。其他绝大多数药物的耐药率较高(50%以上),只有3种药物(美罗培南,阿米卡星和呋喃妥因)耐药率在30%以下,其中美罗培南的耐药率最低(2.3%)。耐药菌株中出现6株对多粘菌素和碳青霉烯类药物同时耐药菌株,提示可能出现了超级耐药菌株。在获取MCR基因全面流行病学数据特征基础上,为深入研究耐药基因的传播机制,本研究对同时携带mcr-1基因和mcr-3基因的一株大肠杆菌C2624进行全基因组测序分析。通过接合实验研究其水平传播能力,结果发现mcr-3基因可单独转移,也可随着mcr-1基因共同转移至受体菌大肠杆菌C600中;其接合频率、接合子耐药表型与基因型对比分析结果表明,仅携带mcr-3基因的第一类接合子的接合频率在5×10-5/donor至5×10-6/donor;而同时携带mcr-1和mcr-3的第二类接合子的接合频率为4×10-3/donor。携带mcr-3基因和同时携带mcr-1、mcr-3基因的两类接合子相比于受体菌C600,对多粘菌素的MIC值分别提高了64倍和512倍。进一步运用RAST软件工具进行基因预测和注释,并使用ResFinder、BLAST和BRIG等软件进行序列比对,绘制质粒图谱进行基因环境分析,结果发现mcr-1 基因所在的IncHI2型质粒结构很稳定,除了极少可变区中的插入序列和转座子及相关蛋白,骨架结构部分非常稳定,不同质粒间的序列覆盖率相当高。而mcr-3基因所在的IncX1型质粒极不稳定,存在多个可变区,可同时存在多个耐药基因、插入序列和转座子蛋白,并且每个耐药基因所在的基因环境也很多变。经进一步比对分析携带mcr-3基因的IncX1型质粒(pYZUC2624.2)可变区和骨架结构部分的特异性,结果判断其形成可能是几株或多株细菌的质粒间不断发生水平传播导致的突变。耐药基因传播机制的研究为临床上多重耐药菌株及超级耐药菌株的防治提供理论依据,也为其他病原菌多粘菌素耐药机制的研究提供借鉴。