论文部分内容阅读
目的利用NGS技术分析四川骨髓库664份造血干细胞捐献志愿者HLA-DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1和DQB1基因多态性及其连锁不平衡,增加四川骨髓库HLA数据,为今后临床HSCT配型研究提供一定的数据支持。方法对四川骨髓库664份造血干细胞捐献志愿者样本进行基因组DNA提取。使用All TypeTM NGS 11-loci Amplification Mix试剂盒,经过文库制备和模板制备后在Ion torrent S5测序仪上进行测序分析,然后使用TSV 1.3.0软件分析结果。对于疑难样本,使用Secore试剂盒在3730XL测序仪上进行测序分型复核,使用u Type 7.2软件分析结果。使用SPSS 20.0软件中的K-均值聚类方法确定HLA-DRB3、DRB4和DRB5的拷贝数。使用Arlequin 3.1软件EM算法计算HLA-DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1 和 DQB1等位基因频率,HLA-DRB3、DRB4 和 DRB5基因频率,HLA-DRB1～DRB3、DRB1～DRB4、DRB1～DRB5、DRB1—DQB1和DQB1～DQA1连锁不平衡参数。结果1.使用 NGS 技术检测 HLA 基因型,HLA-DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1和DQB1高分结果比例分别为 99.85%、100%、100%、100%、100%和 99.85%。检测到3例HLA-DQB1等位基因点突变,第1例检测到基因序列最接近的等位基因为DQB1*03:74,第2外显子nt296位置T变为A,导致第68位的氨基酸由缬氨酸变为天冬氨酸;第2例检测到基因序列最接近的等位基因DQB1*03:03,第2外显子nt335位置G变为A,导致第80位的氨基酸由精氨酸变为赖氨酸;第3例检测到基因序列最接近的等位基因DQB1*05:01,第3外显子nt474位置C变为G,所编码氨基酸不变。此外本次分型中,出现1例HLA-DRB1等位基因漏检,NGS分型给出的结果是DRB1*14:04 DRB1*14:04,经SBT分型检测,分型结果为DRB1*07:01 DRB1*14:04。2.本研究共检测到100种HLA等位基因,包括44种HLA-DRB1、25种HLA-DQB1、16 种HLA-DQA1、4 种HLA-DRB3、4 种HLA-DRB4 和 7 种HLA-DRB5 等位基因。DRB1*09:01:02G、DQB1*03:01:01G、DQB1*03:03、DQA1*01:01、DQA1*01:02、DRB3*02:02、DRB3*03:01、DRB4*01:03和DRB5*01:04分别为上述位点的高频等位基因,频率分别为16.64%、19.82%、17.78%、16.72%、16.64%、23.40%、11.66%、31.33%和 10.69%。3.以HLA-DRB1和DRB3、DRB4、DRB5组装读数百分比为聚类特征,使用K-均值聚类算法,确定664例样本HLA-DRB3、DRB4和DRB5拷贝数,无HLA-DRB3、DRB4、DRB5基因的样本有11个,有1个HLA-DRB3、DRB4和DRB5基因的样本数为147个,有2个HLA-DRB3、DRB4和和DRB5基因的样本数为506个。4.四川骨髓库人群HLA-DRB3、DRB4和DRB5基因频率分别为0.395、0.338和0.143,与美洲印第安人、非洲黑人和西班牙高加索人存在差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.四川骨髓库人群与美洲印第安人分别有3种HLA-DRB3、1种DRB4、2种DRB5和11种DDA1等位基因分布具有差异,与非洲黑人分别有1种HLA-DRB3、2种DRB4和5种DQA1等位基因分布具有差异,与西班牙高加索人分别有2种HLA-DRB3、2种DRB4、1种DRB5和8种DQ41等位基因分布具有差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。DRB3*02:10、DRB4*01:02 DRB5*01:03、DRB5*01:08N、DRB5*02..03、DQA1*05:06、DQA1*05:08和DQA1*06:01是四川骨髓库人群所特有的等位基因,DQA1*06:01为高频等位基因,频率为8.73%。6.本研究调查四川骨髓库664名造血干细胞捐献者,有95%的把握认为频率>0.0023的单体型数据可靠。本研究共检测到15种HLA-DRB1～DRB3、11种DRB1～DRB4、7种DRB1～DRB5、41种DRB1～DQB1 26 种DQB1～DQ41单体型数据可靠,以上单体型连锁不平衡参数具有统计学意义(P<0.05)的分别有8种、4种、1种、37种和24种。结论1.NGS技术分型结果可信,高分结果比例高,适合应用于中华骨髓库入库标准的HLA基因检测,但仍存在HLA-DRB1等位基因漏检和HLA-DQB1分型失败的可能。2.基于NGS技术的测序数据,使用K-均值聚类算法确定了HLA-DRB3、DRB4和DRB5的拷贝数,首次获得四川骨髓库HLA-DRB3、DRB4和DRB5位点基因及等位基因分布。3.四川骨髓库人群HLA-DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQ41和DQB1基因多态性和连锁不平衡具有自身特点,表现为多态性程度较高,高频等位基因分布相对集中,单体型种类较多。HLA-DRB3、DRB4、DRB5和DQA1等位基因分布与美洲印第安人、非洲黑人和西班牙高加索人存在显著差异。