论文部分内容阅读
目的：
黑色素瘤具有恶性程度高、发病范围广、进展程度快、侵袭能力强及预后评估差等特点，是皮肤癌症患者的主要死亡原因之一。早期黑色素瘤可以通过手术切除肿瘤而治愈，然而由于缺乏合适的肿瘤标志物和公共教育，以及在疾病发展到晚期之前没有明显的临床症状，早期黑色素瘤的检测受到了阻碍。而转移性黑色素瘤具有很高的耐药性，因此对转移期患者可用的治疗方案非常有限，放疗、化疗、免疫治疗和生物治疗可以提高患者生存率，但5年生存率通常只有10％-20％，可见现有的针对黑色素瘤的治疗方法仍然不够理想。近年来众多新兴疗法的出现和发展，为多学科联合治疗黑色素瘤提供了更多的可能性，设计合理的联合治疗策略来治疗原发肿瘤，减少肿瘤复发和远处转移成为了一项迫切的重要课题。
光热治疗（PTT）是通过联合运用光热转换剂（PTAs）以及对人体组织穿透力较强的近红外光（NIR）使局部组织温度升高，选择性地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞不造成伤害。基于光杀伤的光热治疗不仅可消除原发肿瘤，肿瘤细胞裂解后的产物还可成为原位疫苗，在免疫佐剂的辅助下，诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫应答。
STING即干扰素基因刺激因子，是胞浆DNA诱导的天然免疫反应中重要的信号转导蛋白，是启动机体天然免疫系统抵御细菌或病毒感染的重要分子，同时在激活下游特异性免疫应答的过程中也发挥着至关重要的作用。STING可诱导I型干扰素及相关细胞因子的产生，同时诱导树突状细胞（DCs）成熟，激活杀伤性T细胞（CTLs），参与宿主的免疫防御功能。
机体氧化应激时会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS是一类氧的单电子还原产物，其中主要的成分是H2O2，可造成DNA损伤和基因不稳定等，并且与多种组织器官损害和肿瘤的发生发展等有密切关联。在肿瘤微环境中，ROS的含量水平明显高于正常组织，利用肿瘤组织与正常组织内ROS水平的差异，设计ROS响应性智能药物递送系统，在肿瘤高ROS水平的环境下释放包裹的药物，可以提高目的药物的靶向性和传递效率。最近水凝胶在智能药物递送系统的开发中得到了广泛的应用。水凝胶是一种亲水聚合物网络，介于固体、液体的中间物质状态，形态柔软类，它可以在水中膨胀，吸收大量的水的同时保持结构稳定，具有良好的亲水性和生物相容性。利用水凝胶递送药物可以保护药物免受有害环境的影响，如溶酶体中的酶和酸性环境。具有对外界环境敏感特性的水凝胶也被称为智能水凝胶。目前许多化学、物理以及生物刺激已被用于诱导各种反应的智能水凝胶系统。化学刺激包括pH值、某些离子和ROS等特定的分子识别，物理刺激包括温度、电场、溶剂组成和光等，生物刺激包括酶和ATP等生物大分子。
本研究旨在研发一种新型ROS响应性水凝胶，可以负载水溶性光敏剂吲哚菁绿（ICG）和STING激动剂（DMXAA），并在肿瘤区域原位注射，用808nm波长的近红外激光低剂量局部照射后产生热量，使肿瘤局部温度升高，通过光热效应联合STING激动剂启动的免疫应答有效杀死黑色素瘤细胞。水凝胶可通过消耗肿瘤部位富集的ROS持续释放药物，具有良好的药物控释缓释功能，还可借此改善肿瘤微环境，为肿瘤的联合治疗提供平台。
方法：
1、H2O/DMSO混合溶液溶解甲硫基乙酸（MAA），加入EDC/NHS活化；醋酸溶解CS，配制成CS溶液；用去离子水配制GP溶液并逐滴滴入CS溶液，将配好的CS-GP前凝胶液逐滴滴入已活化的MAA溶液，离心洗涤除去DMSO和凝胶内气泡备用；同理制备装载ICG或/和STING激动剂的水凝胶。
2、利用扫描电子显微镜（SEM）、流变仪、1H核磁共振、紫外分光光度计、荧光分光光度计等对制备的水凝胶进行表征。
3、37℃水浴条件下，将水凝胶置于EP管中并加入PBS缓冲液或H2O2溶液，不更换PBS缓冲液和H2O2溶液，观察不同时间节点水凝胶的重量变化。
4、37℃水浴条件下，将装载ICG的水凝胶置于EP管中并加入PBS缓冲液或H2O2溶液，每天更换PBS缓冲液和H2O2溶液，观察不同时间节点上清液的OD值。
5、用红外热成像仪检测激光照射下ICG-水凝胶（ICG-gel）和ICG水溶液（ICG-free）的升温情况。
6、用CCK-8法检测水凝胶的细胞毒性。
7、采用C57BL/6Cnc雌性小鼠建立荷瘤小鼠模型，皮下注射B16F10小鼠黑色素瘤细胞；原位注射PBS、ICG-gel、STING-gel、ICG-STING-gel后进行激光照射，使用红外热成像仪进行温度检测和记录。
8、用上述方法建立荷瘤小鼠模型，原位注射PBS、空白水凝胶、ICG-free、ICG-gel后，用小动物荧光成像仪进行荧光值检测。
9、用上述方法建立荷瘤小鼠模型，随机分为4组进行治疗：PBS组、ICG-gel组、STING-gel组、ICG-STING-gel组。治疗后每周2次测量小鼠体重及肿瘤大小，评估治疗效果。
10、在治疗后第18天对不同治疗组小鼠进行安乐处死，并解剖取出重要脏器进行H&E染色，评估治疗方法的安全性。
结果：
1、材料表征结果表明制备的水凝胶呈三维立体网状结构，有良好的流变学性能，且负载药物后流变性能和光学性能无明显改变。
2、细胞毒性实验提示水凝胶对细胞无明显毒性作用。
3、体外降解实验表明水凝胶具有良好的ROS响应性，在ROS环境下更容易发生降解。
4、体外释放实验表明水凝胶在ROS环境下对药物的释放效果更佳，进一步证明了水凝胶的ROS响应性。
5、体外实验ICG-gel比ICG-free在同等剂量激光照射下升温效率更高，且能有效杀死肿瘤细胞，有良好的光热治疗效果。
6、小鼠体内实验ICG-gel比ICG-free在同等实验条件下升温效率更高，可快速达到光热治疗的温度，提示ICG-gel更适用于黑色素瘤的光热治疗。
7、小动物荧光成像提示ICG-gel组较ICG-free组荧光信号更持久，提示水凝胶有良好的缓释作用。
8、小鼠活体治疗结果表明，ICG-STING-gel组小鼠经治疗后肿瘤消退效果最明显，且无明显复发。小鼠体重无明显下降，H&E组织染色未见明显异常，提示治疗生物安全性高。
结论：
成功研发了一款新型ROS响应性水凝胶，其具有良好的注射性、生物安全性和生物可降解性等特质，装载水溶性染料ICG和STING激动剂后可用于肿瘤的原位注射和光热治疗，有效杀死肿瘤组织的同时改善肿瘤微环境。同时该水凝胶有良好的缓释作用，可为肿瘤的光热联合治疗和组织工程、药物递送等领域提供更多的可能性。
黑色素瘤具有恶性程度高、发病范围广、进展程度快、侵袭能力强及预后评估差等特点，是皮肤癌症患者的主要死亡原因之一。早期黑色素瘤可以通过手术切除肿瘤而治愈，然而由于缺乏合适的肿瘤标志物和公共教育，以及在疾病发展到晚期之前没有明显的临床症状，早期黑色素瘤的检测受到了阻碍。而转移性黑色素瘤具有很高的耐药性，因此对转移期患者可用的治疗方案非常有限，放疗、化疗、免疫治疗和生物治疗可以提高患者生存率，但5年生存率通常只有10％-20％，可见现有的针对黑色素瘤的治疗方法仍然不够理想。近年来众多新兴疗法的出现和发展，为多学科联合治疗黑色素瘤提供了更多的可能性，设计合理的联合治疗策略来治疗原发肿瘤，减少肿瘤复发和远处转移成为了一项迫切的重要课题。
光热治疗（PTT）是通过联合运用光热转换剂（PTAs）以及对人体组织穿透力较强的近红外光（NIR）使局部组织温度升高，选择性地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞不造成伤害。基于光杀伤的光热治疗不仅可消除原发肿瘤，肿瘤细胞裂解后的产物还可成为原位疫苗，在免疫佐剂的辅助下，诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫应答。
STING即干扰素基因刺激因子，是胞浆DNA诱导的天然免疫反应中重要的信号转导蛋白，是启动机体天然免疫系统抵御细菌或病毒感染的重要分子，同时在激活下游特异性免疫应答的过程中也发挥着至关重要的作用。STING可诱导I型干扰素及相关细胞因子的产生，同时诱导树突状细胞（DCs）成熟，激活杀伤性T细胞（CTLs），参与宿主的免疫防御功能。
机体氧化应激时会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS是一类氧的单电子还原产物，其中主要的成分是H2O2，可造成DNA损伤和基因不稳定等，并且与多种组织器官损害和肿瘤的发生发展等有密切关联。在肿瘤微环境中，ROS的含量水平明显高于正常组织，利用肿瘤组织与正常组织内ROS水平的差异，设计ROS响应性智能药物递送系统，在肿瘤高ROS水平的环境下释放包裹的药物，可以提高目的药物的靶向性和传递效率。最近水凝胶在智能药物递送系统的开发中得到了广泛的应用。水凝胶是一种亲水聚合物网络，介于固体、液体的中间物质状态，形态柔软类，它可以在水中膨胀，吸收大量的水的同时保持结构稳定，具有良好的亲水性和生物相容性。利用水凝胶递送药物可以保护药物免受有害环境的影响，如溶酶体中的酶和酸性环境。具有对外界环境敏感特性的水凝胶也被称为智能水凝胶。目前许多化学、物理以及生物刺激已被用于诱导各种反应的智能水凝胶系统。化学刺激包括pH值、某些离子和ROS等特定的分子识别，物理刺激包括温度、电场、溶剂组成和光等，生物刺激包括酶和ATP等生物大分子。
本研究旨在研发一种新型ROS响应性水凝胶，可以负载水溶性光敏剂吲哚菁绿（ICG）和STING激动剂（DMXAA），并在肿瘤区域原位注射，用808nm波长的近红外激光低剂量局部照射后产生热量，使肿瘤局部温度升高，通过光热效应联合STING激动剂启动的免疫应答有效杀死黑色素瘤细胞。水凝胶可通过消耗肿瘤部位富集的ROS持续释放药物，具有良好的药物控释缓释功能，还可借此改善肿瘤微环境，为肿瘤的联合治疗提供平台。
方法：
1、H2O/DMSO混合溶液溶解甲硫基乙酸（MAA），加入EDC/NHS活化；醋酸溶解CS，配制成CS溶液；用去离子水配制GP溶液并逐滴滴入CS溶液，将配好的CS-GP前凝胶液逐滴滴入已活化的MAA溶液，离心洗涤除去DMSO和凝胶内气泡备用；同理制备装载ICG或/和STING激动剂的水凝胶。
2、利用扫描电子显微镜（SEM）、流变仪、1H核磁共振、紫外分光光度计、荧光分光光度计等对制备的水凝胶进行表征。
3、37℃水浴条件下，将水凝胶置于EP管中并加入PBS缓冲液或H2O2溶液，不更换PBS缓冲液和H2O2溶液，观察不同时间节点水凝胶的重量变化。
4、37℃水浴条件下，将装载ICG的水凝胶置于EP管中并加入PBS缓冲液或H2O2溶液，每天更换PBS缓冲液和H2O2溶液，观察不同时间节点上清液的OD值。
5、用红外热成像仪检测激光照射下ICG-水凝胶（ICG-gel）和ICG水溶液（ICG-free）的升温情况。
6、用CCK-8法检测水凝胶的细胞毒性。
7、采用C57BL/6Cnc雌性小鼠建立荷瘤小鼠模型，皮下注射B16F10小鼠黑色素瘤细胞；原位注射PBS、ICG-gel、STING-gel、ICG-STING-gel后进行激光照射，使用红外热成像仪进行温度检测和记录。
8、用上述方法建立荷瘤小鼠模型，原位注射PBS、空白水凝胶、ICG-free、ICG-gel后，用小动物荧光成像仪进行荧光值检测。
9、用上述方法建立荷瘤小鼠模型，随机分为4组进行治疗：PBS组、ICG-gel组、STING-gel组、ICG-STING-gel组。治疗后每周2次测量小鼠体重及肿瘤大小，评估治疗效果。
10、在治疗后第18天对不同治疗组小鼠进行安乐处死，并解剖取出重要脏器进行H&E染色，评估治疗方法的安全性。
结果：
1、材料表征结果表明制备的水凝胶呈三维立体网状结构，有良好的流变学性能，且负载药物后流变性能和光学性能无明显改变。
2、细胞毒性实验提示水凝胶对细胞无明显毒性作用。
3、体外降解实验表明水凝胶具有良好的ROS响应性，在ROS环境下更容易发生降解。
4、体外释放实验表明水凝胶在ROS环境下对药物的释放效果更佳，进一步证明了水凝胶的ROS响应性。
5、体外实验ICG-gel比ICG-free在同等剂量激光照射下升温效率更高，且能有效杀死肿瘤细胞，有良好的光热治疗效果。
6、小鼠体内实验ICG-gel比ICG-free在同等实验条件下升温效率更高，可快速达到光热治疗的温度，提示ICG-gel更适用于黑色素瘤的光热治疗。
7、小动物荧光成像提示ICG-gel组较ICG-free组荧光信号更持久，提示水凝胶有良好的缓释作用。
8、小鼠活体治疗结果表明，ICG-STING-gel组小鼠经治疗后肿瘤消退效果最明显，且无明显复发。小鼠体重无明显下降，H&E组织染色未见明显异常，提示治疗生物安全性高。
结论：
成功研发了一款新型ROS响应性水凝胶，其具有良好的注射性、生物安全性和生物可降解性等特质，装载水溶性染料ICG和STING激动剂后可用于肿瘤的原位注射和光热治疗，有效杀死肿瘤组织的同时改善肿瘤微环境。同时该水凝胶有良好的缓释作用，可为肿瘤的光热联合治疗和组织工程、药物递送等领域提供更多的可能性。