H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)是一种在犬群中流行的能够引起犬咳嗽、高热、肺炎甚至死亡的高度接触性传染病。犬流感病毒不仅对犬类的生存和健康带来严重的危害,同时也给人类健康带来巨大的风险,如果能够制备针对犬流感病毒的有效单抗,并阐明犬流感病毒的感染机制,无疑将有效地促进对犬流感病毒感染的预防和控制。然而,目前却尚无针对H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体,亦没有研究该病毒的合适细胞模型。因此,本研究制备了针对H3N2亚型犬流感病毒的保护性单克隆抗体,并建立了永生化的犬细支气管上皮细胞作为研究犬流感病毒的细胞模型。另外,本研究还获得了原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞感染H3N2亚型犬流感病毒后的microRNA差异表达谱,并对其中的3个microRNA的作用进行了研究,研究结果表明宿主细胞在被犬流感病毒感染后,能够通过改变microRNA的水平来影响病毒在细胞内的复制,研究结果有助于阐明犬流感病毒感染宿主细胞的分子机制。1. H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体的制备及相关特性分析在对H3N2亚型犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010 (JS/10)株进行扩增和纯化的基础上,以全病毒作为免疫抗原皮内多点注射免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合及杂交瘤细胞的亚克隆,获得了7株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,随后利用7株杂交瘤细胞制备了腹水并进行纯化,最终获得了 7株单克隆抗体,并对单克隆抗体的特性进行了分析。其中,单抗D7的中和效价达了 1:12800,并且对不同的H3N2亚型流感病毒株具有交叉反应性;Western blot鉴定结果表明,该单抗所针对的抗原表位位于相对保守的HA2片段。本研究制备的针对H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体,为该病毒的检测及其感染的治疗提供了物质基础,具有潜在的应用价值。2.单克隆抗体对不同H3N2亚型流感病毒株感染的保护作用为评估单克隆抗体D7对H3N2亚型犬流感病毒感染的保护作用,本研究以BALB/c小鼠为感染模型,评估了单抗D7对H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株JS/10、广东分离株GD/12以及H3N2亚型猪流感病毒山东分离株SD/05感染的保护效果。将单抗D7预先给小鼠注射后,分别感染上述3种流感病毒,并以非相关单抗、单独病毒感染以及PBS作为对照,于病毒感染后第2、4、6、10和14天等5个时间点,分别测定小鼠体重,血液、粪便及不同脏器中的病毒载量,以及肺组织中的细胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平。同时,对小鼠的肺、心、脑3种脏器进行组织病理学观察及免疫组化分析。实验结果表明,单抗D7对以上3株H3N2亚型流感病毒株的感染均起到了一定的免疫保护作用,其中对JS/10株的保护效果最好,表现为腹腔注射单抗D7后,较好的维持了感染小鼠的体重,降低了各脏器的病毒载量,并减轻了病毒感染对各脏器所造成的组织病理损伤,降低了与病毒感染相关的IFN-γ和TNF-α表达水平。本研究说明单抗D7对H3N2亚型流感病毒感染具有良好的防控效果。3. 永生化犬细支气管上皮细胞系的建立及其特征分析为深入研究犬流感病毒的致病机制,本研究分离并培养了原代犬细支气管上皮细胞(CBECs),并在此基础上,将端粒酶(hTERT)基因以真核重组表达质粒(pEGFP-hTERT)的形式转入CBECs中,建立了永生化的犬细支气管上皮细胞系(hTERT-CBECs )。特性分析表明,永生化的hTERT-CBECs保留了原代细胞的形态和功能特征;实时定量PCR(qRT-PCR)、增殖试验、核型分析、端粒酶活性检测以及Western blot等方法证实,永生化犬细支气管上皮细胞传至第50代,仍具有很强的端粒酶活性、延长的增殖寿命以及二倍体染色体特征;软琼脂分析和裸鼠体内致瘤性试验均表明,该永生化细胞系不具有致瘤性。本试验获得的原代犬细支气管上皮细胞及永生化犬细支气管上皮细胞系,为探讨犬流感病毒等呼吸道病原的感染机制提供了重要的生物材料。4. CIV感染犬原代细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的microRNA表达谱分析分离培养了原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞,并通过small RNA测序和microRNA基因芯片测序,获得了以上两种细胞在感染H3N2亚型犬流感病毒后的microRNA表达谱。分析结果表明,在原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞中,分别检测到了421和292个microRNA (miRNA)的表达,其中差异表达倍数在2倍以上的miRNA分别有117个和71个。通过TargetScan、PITA和miRanda数据库对这些差异表达miRNA的靶基因进行预测,并在Gene Ontology和KEGG数据库中对这些靶基因的功能进行预测注释,结果表明这些差异表达miRNA主要参与抗病毒应答,凋亡应答和趋化因子细胞因子炎性应答等信号通路。另外,试验还通过qRT-PCR对测序结果进行了验证,结果表明qRT-PCR结果与测序结果中miRNA的表达水平变化趋势一致,说明测序结果较可靠。研究所得到的miRNA表达谱,为犬流感病毒致病机制的研究提供了重要信息。5.宿主细胞microRNA对H3N2亚型犬流感病毒复制的影响选择病毒感染后表达水平显著下调的3个miRNA: cfa-miR-125b、cfa-miR-151和cfa-miR-423a,并对其在细胞抵抗病毒感染中的作用展开研究。试验以永生化的犬细支气管上皮细胞(hTERT-CBECs)和犬巨噬细胞系(DH82)为基础,分别以腺病毒载体和慢病毒载体,构建了3个miRNA的稳定过表达和抑制细胞系,然后分析3个miRNA过表达或者表达被抑制后,对病毒在相应细胞中的复制能力进行评估,同时对感染细胞中病毒的NP和NS1表达水平进行检测。研究结果显示,cfa-miR-125b和cfa-miR-151的过表达能够促进病毒的复制,而当这两种miRNA的表达被抑制后,则会导致病毒复制能力显著下降,而cfa-miR-423a的过表达和抑制则对病毒的复制能力没有明显影响。同时qRT-PCR和Western blot检测结果也显示cfa-miR-125b和cfa-miR-151的过表达和抑制分别能够提高和降低NP和NS1的表达水平,并且这种现象在hTERT-CBECs和DH82细胞中均存在。此外,在上述两种细胞中,无论cfa-miR-423a过表达还是抑制都能抑制NP的表达水平,而对NS1的表达水平没有影响。本试验表明,当细胞受到H3N2犬流感病毒感染后,可以通过改变自身的miRNAs水平来调控病毒的复制。该研究有助于进一步阐明细胞对病毒感染的抵抗机制。