肠致病性大肠杆菌(EPEC)感染是引起小儿水样性腹泻的主要因素。EPEC感染宿主肠上皮细胞可造成A/E损伤,其主要特征为细菌与宿主细胞膜的紧密粘附,并伴有微绒毛的消失以及由F-肌动蛋白迁移到细菌粘附部位形成的脚踏板结构。AE损伤是由细菌染色体上的肠细胞脱落位点(Locus of enterocyte effacement,LEE)基因簇编码的一系列致毒蛋白引发的。这些致毒蛋白由III型分泌系统转运到宿主细胞内发挥作用。EspF是一类EPEC分泌蛋白,具有多种功能如抗吞噬、诱导细胞凋亡、破坏紧密连接、引发中间纤维降解以及水孔蛋白移位。目前研究发现,在体外EspF可以降低TER以及改变肠上皮细胞紧密连接结构。肠上皮细胞间的紧密连接(TJ)构成了肠道的保护屏障,它可以阻止病原微生物的入侵。TJ调控细胞间通透性,它可以形成一道选择性屏障,只允许营养物质、水和溶质进入,而阻止大分子物质和病原菌通过。体外研究证明EPEC感染降低上皮细胞单层TER,引起紧密连接蛋白解聚和移位,诱导occludin去磷酸化并从肠上皮解离,破坏紧密连接结构和屏障功能。肠道固有菌群对宿主具有重要作用,如促进营养物质代谢、促进宿主免疫系统的正常发育并维持其稳定性。此外,肠道内固有菌群可以有效阻止其他病原微生物的定植,这一作用通常被称作“群落抵抗”(colonization resistance)。肠道固有菌群还可以促进肠粘膜上皮的发育。正常生理情况下,肠道菌群组成结构稳定。某些疾病状况下,如炎性肠病(IBD)、肥胖症甚至结肠癌常伴有肠道菌群失衡。目前有关EPEC对紧密连接影响的报道主要是以体外培养细胞作为研究模型。EPEC在体内对紧密连接有何影响,以及EPEC感染引起的宿主肠道菌群变化还未见相关报道。本实验中我们采用EPEC感染小鼠模型研究EPEC感染对紧密连接蛋白分布和紧密连接屏障功能的影响,并确定EspF的作用；利用16S rRNA PCR-DGGE分析研究EPEC感染对宿主肠道菌群的影响；确定紧密连接膜微区域在EPEC侵入宿主细胞过程中的作用。第一部分：肠致病性大肠杆菌EPEC感染肠粘膜屏障损伤的分子基础目的：研究体内肠致病性大肠杆菌感染对紧密连接结构、紧密连接蛋白在紧密连接膜微区域分布和肠上皮屏障功能的影响。方法：C57/BL6J/、鼠随机分为对照组、EPEC感染1 d、3 d和5 d组,以及突变型菌株UMD874感染1 d、3d和5 d组(每组4只小鼠)。每只小鼠每天灌胃200μl菌液(2×108细菌)建立EPEC体内感染模型。常规HE染色观察EPEC感染后肠组织形态学改变,透射电镜研究紧密连接超微结构变化,采用生物素作为示踪剂研究结肠通透性改变。激光共聚焦观察紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1、 claudin-3和claudin-5在肠上皮细胞的分布变化。利用Western blot分析紧密连接蛋白occludin和claudin-1在紧密连接微区域的分布。结果：实验结果表明,EPEC感染破坏紧密连接超微结构。紧密连接形态学的改变伴有上皮细胞间通透性的增加,表现为生物素穿过上皮,渗透进入粘膜固有层。激光共聚焦观察发现EPEC感染导致紧密连接蛋白从绒毛顶端肠上皮细胞膜移位到胞浆内。Western blot分析揭示EPEC感染引发紧密连接蛋白occludin和claudin-1由紧密连接膜微区域移位到Triton-X 100可溶组分中。此外,研究发现突变菌株UMD874对紧密连接的破坏作用较野生型菌株小。结论：EPEC感染引起紧密连接蛋白在紧密连接膜微区域的分布发生移位,导致紧密连接屏障功能受损。EPEC分泌蛋白EspF在EPEC感染早期阶段具有重要作用。第二部分：肠致病性大肠杆菌EPEC感染肠道菌群结构变化目的：研究EPEC感染对宿主肠道菌群的影响,并比较野生型菌株与突变菌株对宿主肠道菌群影响的差异性。方法：除感染时间延长至21 d外,EPEC感染模型建立同第一部分实验。实验所用菌株为野生型菌株EPEC 2348/69和突变型菌株UMD874。采用16S rRNA PCR-DGGE分析EPEC感染后宿主肠道菌群的变化。小肠隐窝潘氏细胞变化采用常规组织病理学观察。结果：采用UPGMA分析方法对DGGE指纹图谱分析发现,EPEC感染明显改变宿主粪便和结肠粘膜相关菌群结构,感染21d后菌群有所恢复,与对照相似度只有58%和54%。与野生型菌株相比,突变型菌株对宿主肠道菌群影响较小,感染21d后菌群开始恢复。此外,EPEC感染后潘氏细胞分泌颗粒有所增加。结论：EPEC感染引起宿主肠道菌群发生明显改变,感染后期宿主肠道菌群结构有所恢复。突变菌株对宿主肠道菌群的影响较野生型EPEC作用小。第三部分：肠致病性大肠杆菌EPEC易位途径目的：通过建立EPEC体外感染细胞模型,研究EPEC形成细菌易位的途径以及细菌易位形成的分子结构基础。方法：用Transwell细胞培养板培养Caco-2细胞至长成细胞单层后接种EPEC。采用EVOM电压电阻仪测定细胞跨膜电阻抗(TER)变化,紧密连接蛋白分布变化采用Western blot分析和激光共聚焦观察。激光共聚焦和透射电镜观察EPEC侵入细胞的过程。结果：EPEC粘附到Caco-2细胞表面造成典型的AE损伤。EPEC感染导致细胞单层TER值显著降低。激光共聚焦观察发现EPEC感染导致紧密连接蛋白ZO-1和occludin脱离细胞膜上的紧密连接微区域移位到细胞浆内。蔗糖密度梯度离心和Western blot分析显示,脂筏标志蛋白flotillin-1和紧密连接蛋白occludin从TritonX-100不溶膜组分移位到TritonX-100可溶组分。Flotillin-1聚集到EPEC侵入细胞的位点。激光共聚焦和透射电镜观察发现EPEC通过紧密连接进入细胞内。结论：EPEC感染导致紧密连接蛋白移位,破坏肠上皮屏障功能。紧密连接蛋白与EPEC共定位,EPEC通过紧密连接微区域进入宿主细胞,紧密连接膜微区域是EPEC易位形成的关键部位。