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罗汉果甜苷V(Mogrosides V)从果实中提取率很低,但若想要达到工业化生产水平,可以通过在植物悬浮细胞中添加诱导子的方式来提高次生代谢产物含量。细胞悬浮培养技术不受自然条件的限制,是一种提高次生代谢物产量的有效途径。但是至今关于罗汉果细胞悬浮培养的研究较少,尤其是关于反应器放大培养方面。为此,本论文从以下方面进行研究:(1)诱导子的筛选,寻找最适的添加浓度和添加时间,提高甜苷V产量。(2)通过对摇瓶中碳氮磷元素的筛选,寻找限制性因素。(3)建立反应器上的培养模式,实现5 L搅拌式生物反应器的扩大培养。(4)对盐胁迫下罗汉果悬浮细胞的生理生化响应进行了研究,结合胞内外中间代谢物浓度的变化,分析产物合成的可能路径。具体结果如下:1.诱导子对罗汉果悬浮细胞生长及甜苷V合成的影响对苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)、茉莉酮酸甲醋(Methyl jasmonate,MJA)、水杨酸(Salicylic acid,SA)、甜菜碱(Betain)、壳聚糖(Chitosan)和氟化钠(NaF)等诱导子进行浓度和添加时间的研究,选择合适的诱导子进行正交优化。研究结果表明:单因素实验中Phe、MJA、SA三者诱导结果较优,正交试验结果:诱导子应该选择在第6天添加,且浓度为 MJA 120 μmol/L+SA 40 μmol/L+Phe 100 μmol/L,甜苷 V 产量达到0.83 mg/g DCW,是对照的10倍。因此,诱导子添加可以显著促进甜苷V的合成。2.罗汉果细胞悬浮培养工艺优化及反应器放大培养通过对碳氮磷源底物进行摇瓶筛选,得出主要影响因素和合适的添加浓度范围,再在两种反应器建立培养模式。研究结果表明:从碳源(蔗糖,Sucrose)、氮源(硝酸铵,NH4N03)、磷源(磷酸二氢钠,NaH2P04)三类底物中筛选发现氮源为主要限制因素,且NH4N03合适的添加范围为30-150 mg/L,当NH4N03浓度为150 mg/L时,细胞达到最大生物量和最高比生长速率,分别为7.15 g/L和0.0601 d-1。比较5 L鼓泡式和5 L机械式生物反应器试验可知,机械式反应器于第21天时细胞的生物量是初始接种量的2.8倍,鲜重达到了 140 g/L;而鼓泡式反应器中的细胞生物量鲜重只有100 g/L,仅是初始的2倍。故而,机械式反应器更适合于罗汉果细胞的悬浮扩大培养,而鼓泡式反应器剪切力太小细胞易结团,影响传质。3.盐胁迫对罗汉果悬浮细胞生长及甜苷V合成的影响初始培养基中K+/Na+比例变化对细胞的生长和生理响应有重要的影响。K+/Na+比15:1是罗汉果悬浮细胞的最优浓度比,K+/Na+比太高或者太低均不促进细胞生长和甜苷V生物合成。当K+/Na+比为15:1时,罗汉果悬浮细胞生长量最多,细胞干重达到11.67 g/L,同时甜苷V产量最高,为0.42 mg/g DCW,分别是对照的2倍和1.4倍;细胞内K+浓度、K+/Na+、S(K,Na)值均为最大,细胞利用K+效率最高,细胞生长速率最快;蔗糖代谢中间产物如苹果酸、甲酸、丙氨酸和支链氨基酸等有机酸和氨基酸代谢分析表明,其共同作用有可能减弱TCA循环代谢强度,但可以增强EMP途径和MVA途径代谢的强度,从而促进萜类化合物前体乙酰CoA向罗汉果甜苷V合成。