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多种多样的细菌共同生活在同一个微生物群落中,为了有限的空间和资源,细菌之间需要进行激烈的竞争或合作。同类细胞之间可以产生大量有利于自身存活的合作行为,包括营养获得、群体运动、毒力保存、离子吸收、生物膜形成和子实体生成等。为了确保这些合作行为发生在同类细胞之间,细菌细胞需要对邻近细胞进行亲缘辨别。菌落融合不兼容是细菌中广泛存在的一种亲缘辨别表型,同类菌株的两个菌落相遇后可以融合,两个非同类菌株的菌落相遇后形成一条肉眼可见的界线。菌落融合不兼容表型最初在奇异变形杆菌Protus mirbilis中发现,最近在其他细菌中陆续被报道,其中涉及的分子遗传机制也正在被广泛研究。粘细菌是来自6变形杆菌纲,粘细菌目的革兰氏阴性细菌。其中,黄色粘球菌MyxococcusxanthusDK1622为模式菌株,已完成测序。黄色粘球菌具有多种多细胞行为,也被称为社会性细菌。在营养丰富的固体表面,黄色粘球菌多细胞协作进行群体运动。当营养匮乏时,黄色粘球菌多细胞聚集形成子实体,约99%细胞死亡,仅1%细胞成为抗逆性孢子,在营养丰富后,孢子可萌发成为营养细胞。此外,黄色粘球菌细胞会分泌大量抗生素和胞外酶类来协作捕食其他微生物细胞。黄色粘球菌的多细胞行为给予自身远超单个分散细胞的生存优势。实验室前期通过转座子随机插入获得了 3392个插入突变株,从中筛选得到11株异己识别突变株。这些异己识别突变株与MxanthusDK1622菌株之间形成菌落界线。插入基因位点分散分布在M xanthus DK1622基因组中,大多为未知功能的假定蛋白。此外,这些异己识别突变株自身的生长、运动、子实体发育和生孢能力正常。值得关注的是,这些突变株与野生菌株DK1622等量混合共发育/共培养时,展示出不同的竞争能力。与DK1622菌株共发育/共培养时,多数异己识别突变株的生孢/生长能力显著弱于自身单独生孢/生长、弱于DK1622菌株单独生孢/生长、也弱于共培养的DK1622菌株。而SI03/SI11突变株与DK1622菌株共发育/共培养时,两个菌株与各自单独情况下相比,无明显变化。此外,异己识别突变株之间也会形成明显的菌落界线,这些插入基因涉及的亲缘辨别功能可能是独立或不同的。进一步分析插入基因发现,其中5个异己识别突变株的插入基因是同源的,并且这五个基因上游紧邻的基因也是同源的。插入基因的同源基因编码一类分子量较小的酸性蛋白,功能未知。上游基因的同源基因编码一类分子量较大的碱性蛋白,多序列比对结果显示包含多个高保守的碱性氨基酸位点,保守的’AHH’基序,可能是一类新型核酸酶。插入基因的同源基因单敲除突变株与相应的异己识别突变株菌落融合,与DK1622菌株形成明显的菌落界线。上游基因的同源基因单敲除突变株与DK1622菌株的菌落融合,与相邻的插入基因单敲除突变株菌落也融合。因此这两组同源基因可能编码了一对具有拮抗作用的核酸酶及其抑制蛋白。同时,这两组同源蛋白之间具有相对应的进化关系,可能是协同进化的。五个插入基因的单基因敲除突变株之间也形成菌落分界线,说明这五对同源基因可能是独立行使功能的。基于SI01突变株的插入基因MXAN0049和上游紧邻的MANN0050基因为中心,研究其中的亲缘辨别机制。MXAN0049基因缺失突变株与野生菌株DK1622菌落融合不兼容,与SI01菌株的菌落融合。MXAN0049与MXAN0050基因紧密相邻且共转录。MXAN—0050基因缺失突变株与DK1622菌株的菌落融合,同时与SI01菌株或MXAN0049基因缺失突变株菌落也融合。在基因缺失突变株分别回补相应的缺失基因后,表型得到恢复,与野生菌株一致。这些菌株的菌落融合不兼容表型与MXAN0050和MXAN0049蛋白是功能相拮抗的核酸酶及其抑制蛋白的推测是一致的。为了证明这一推测,在大肠杆菌中将MXAN0050蛋白进行异源表达纯化,获得的MXAN0050蛋白可以消化基因组DNA,若MXAN0049蛋白和MXAN0050蛋白同时存在时,基因组DNA则不被消化。MXAN0050和MXAN0049蛋白也被证明具有蛋白-蛋白相互作用。进一步将MXAN0050蛋白在大肠杆菌中诱导表达,其宿主菌的生长受到抑制,低浓度菌液不能生长;如MXAN0049蛋白与MXAN0050蛋白在大肠杆菌中共表达,其宿主菌的生长则不受抑制,低浓度菌液仍可以生长。在大肠杆菌中证明了 MXAN0050蛋白是毒素,而MXAN0049蛋白可免疫其毒性。若将MXAN0049基因敲除突变株与DK1622菌株共培养,MXAN0049基因敲除突变株被DK1622菌株杀死;MXAN0049基因敲除突变株与MXAN0050基因敲除突变株共培养,二者可以共存。因此,在黄色粘球菌中,MXAN0050和MXAN0049蛋白是一对核酸酶毒素和免疫蛋白,介导了菌落融合不兼容的产生。在邻近菌落融合不兼容或共培养过程中,MXAN0050核酸酶作为毒素发挥作用,应在细胞间进行转移。而我们在MXAN0050蛋白没有预测到信号肽或跨膜域,搜索MXAN0050基因的上下游发现一个可能与蛋白质输出有关的MXAN0044基因。MXAN0044基因编码蛋白被预测为PAAR蛋白,而PAAR蛋白是Ⅵ型分泌系统（T6SS）的结构组分,可以携带效应物蛋白从一个细胞转移到接触的另一细胞内。MXAN0044基因缺失突变株与野生菌株DK1622菌落融合,与SI01菌株或MXAN0049基因缺失突变株菌落也融合。MXAN0049基因缺失突变株可以与MX4N0044基因缺失突变株共存。同时,在DK1622基因组中有一个完整的t6ss基因簇,文献报道这个基因簇可以工作,是一个具有功能的T6SS。将t6ss基因簇的几个关键基因进行敲除,敲除突变株类似地与DK1622或SI01菌株菌落融合。MXAN0049基因缺失突变株与t6ss基因缺失突变株可以共存。通过这些预测和突变株表型推测MXAN0050核酸酶应是通过PAAR-T6SS的联合作用输出到邻近细胞中发挥毒素作用的。将MXAN0044和MXAN-0050基因的其他周边基因也进行单基因敲除,检测这些突变菌株的菌落融合表型,MXAN0045、MXAN0051 和 MXAN0052 基因缺失突变株与 DK1622 或MXAN0049基因缺失突变株的菌落融合,这三个基因可能与MXAN0050核酸酶的输出有关;MXAN0043和MXAN0048基因缺失突变株的菌落与DK1622菌株的菌落融合,而与MXAN0049基因缺失突变株的菌落形成界线,可能与菌落融合不兼容机制无关;MXAN0046和MXAN0047基因是MXAN0049基因的同源基因,但这两个基因缺失突变株与MXAN0049基因缺失突变株间形成明显的菌落界线,说明这两个基因不能弥补MXAN0049基因的功能。这些推测仍需更多实验证据进行证明。通过本文研究,给出一种简单的黄色粘球菌中基于核酸酶毒素与免疫蛋白的亲缘辨别模型。在黄色粘球菌DK1622中,MXAN0050基因编码核酸酶毒素,而这个毒素可能被MXAN0044基因编码的PAAR蛋白所携带。PAAR蛋白携带毒素并结合在T6SS的顶端,随后输出到邻近细胞中。野生菌株DK1622细胞含有MXAN0049免疫蛋白,故不被另一 DK1622细胞输入的MXAN0050核酸酶毒素所伤害。而MXAN0049基因缺失的细胞被邻近细胞输入的MXAN0050核酸酶毒素杀伤。因此,MXAN0049基因缺失突变株与DK1622菌株混合共培养时,肥MXAN0049基因缺失突变株被DK1622菌株杀死;MXAN0049基因缺失突变株与DK1622菌株邻近培养时,二者菌落相遇处由于MXAN0049基因缺失细胞被杀死而形成菌落分界线。而缺少MXAN0050基因的细胞不含有核酸酶毒素,不能伤害MXAN0049基因缺失细胞,二者可以共存,菌落融合。MXAN0044或t6ss基因缺失细胞不再输出MXAN0050核酸酶毒素,它们也可以与MXAN0049基因缺失细胞共存,菌落融合。同源的五对核酸酶毒素与免疫蛋白在黄色粘球菌的菌落融合不兼容中独立发挥作用。只有两个菌株包含完全一样的五种免疫蛋白才会认为彼此是同类菌株,二者的菌落相遇时融合。若两种不同的免疫蛋白缺失突变株相遇时,由于各自缺少免疫蛋白,被相应的核酸酶毒素杀死,两种细胞互相残杀,菌落不融合,形成界线。基于五对同源的核酸酶毒素与免疫蛋白,在黄色粘球菌DK1622中组合形成25个亲缘辨别密钥,可产生32种不兼容型。若任何一个亲缘辨别相关基因发生突变,都会产生新的不兼容型。而菌落融合不兼容的存在又使得不兼容的菌株可以共存,这样,群体中的遗传多样性大大提升。面对变化的环境,多样性的群体适应能力也会提高。最终,种群被保存。