论文部分内容阅读
研究背景与目的： 肝细胞癌发病率及死亡率高，是世界公认的最常见的恶性肿瘤之一，死亡率仅次于肺癌和胃癌，5年生存率仅为5％左右。HCC发病隐匿，病程进展快、早期诊断困难，对放化疗不敏感。过去的几十年在肝细胞癌的治疗方面取得了一定的进展，但是依然无法解决肝癌易复发和5年生存率低等问题。因此有效阻断肝癌进展和寻找特异性治疗方法依然是目前亟待解决的问题。ALC1基因位于染色体1q21，有一个SNF2_N结构域和解旋酶超家族结构域，编码897个氨基酸组成的蛋白质。研究表明在肝癌、肺癌和胃癌等实体瘤中高表达，与肿瘤预后正相关，另有研究报道ALC1在胚胎干细胞、成体干细胞中均有表达，与细胞的增殖分化密切相关，故以ALC1为靶标的治疗存在局限性。表皮生长因子（EGF）是强力细胞分裂促进因子，与胚胎发生发育、组织再生修复以及肿瘤发生等过程有关。EGF通过与其受体EGFR结合激活下游信号通路而发挥作用。大量研究证明EGFR在多种肿瘤组织中有高表达，EGFR特异性阻断剂在乳腺癌、肺癌的靶向治疗中疗效显著，但是否适用于其它类别肿瘤如肝癌的治疗仍未有定论。本课题组前期实验发现干扰ALC1可抑制MEK下游信号通路活性,提示ALC1与EGF/EGFR信号通路作用有重叠，但ALC1与EGFR之间是否存在关联目前尚不清楚，本文拟对此进行深入探讨。 方法： 1、采用肝癌组织相邻切片的免疫组织化学方法及免疫荧光双标技术检测临床肝癌标本（肝癌及癌旁组织芯片）及肝癌细胞系ALC1与EGFR表达及定位；ALC1与EGFR表达的相关性分析。 2、荧光实时定量PCR及Westernblot方法检测EGF对肝癌BEL-7402和QGY-7703细胞ALC1表达的影响。 3、平板克隆、MTS、细胞划痕及Transwell等实验观察EGF/EGFR信号对ALC1促肝癌BEL-7402和QGY-7703细胞恶性表型作用的影响，探讨EGF/EGFR信号与ALC1表达的关系。 4、用EGF处理ALC1敲减细胞株8024-shALC1及其对照组8024-shCtr细胞,Westernblot方法检测EGF对ALC1及EGF/EGFR下游信号分子MEK和ERK的影响；细胞生物学表型检测验证EGF/EGFR对ALC1促肝癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移及上皮间质转化等恶性表型特征的介导作用。 结果： 1、肝癌组织芯片免疫组织化学检测显示ALC1阳性表达率为64.8%(35/54)，EGFR阳性表达率为70%(38/54)，ALC1和EGFR共表达率为51.8%，两者的表达呈正相关（r=0.662,P＜0.05）。免疫荧光双标记显示肝癌BEL-7402和QGY-7703中有ALC1与EGFR的共表达。 2.肝癌SMMC-7721、Huh7、HepG2、BEL-7402、CRL-8024和QGY-7703细胞均有ALC1的表达；EGF处理30分钟后BEL-7402和QGY-7703细胞即有ALC1表达增强； 3.当用EGFR抑制剂Afatinib阻断EGFR后给予EGF处理，BEL-7402和QGY-7703细胞ALC1表达水平均明显低于EGF处理组；MTS、平板克隆实验、划痕实验及EMT相关蛋白检测结果显示EGF可明显促进BEL-7402和QGY-7703细胞的增殖、侵袭及迁移，促进EMT相关蛋白表达变化；阻断EGFR后给予EGF对BEL-7402和QGY-7703细胞的增殖、迁移、EMT相关蛋白表达等无明显影响。 4.EGF处理ALC1敲减细胞株8024-shCtr/8024-ALC1shRNA细胞，结果显示ALC1表达水平与EGF/EGFR下游信号分子MEK和ERK的磷酸化程度有关；用EGF处理8024-ALC1shRNA细胞可明显回调其ALC1表达，同时促进细胞的增殖、迁移和侵袭作用，与8024-shCtr组相比差别有显著性意义（P＜0.05）。敲减ALC1所致的细胞表型特征改变如E-Cadherin高表达、N-Cadherin及Vimentin低表达可因EGF处理而回调。 结论： 1、肝癌组织中EGFR表达与ALC1表达正相关。 2、EGF/EGFR信号可上调肝癌细胞ALC1的表达。 3、ALC1促肝癌细胞恶性表型转变依赖于EGFR磷酸化，ALC1通过激活EGF/EGFR下游信号分子MEK\ERK促进肝癌细胞恶性表型转变。