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本研究通过对半知菌生物降解过程中木质素酶和纤维素酶的动力学及漆酶分子生物学的研究,取得如下进展:
(1)应用固体发酵方法,研究了Alternaria sp.,Penicillum sp.,Cephalosporiumsp.,Tricherderma sp.,Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 6种土壤半知菌降解马尾松凋落叶片过程中产生的漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP),羧甲基纤维素酶(CMCase)和滤纸糖酶(FPA)的动力学曲线,以及各种酶活与底物降解的关系。结果表明:Pestalotiopsis sp.能够产生相对较高的漆酶活性和引起底物的总有机物质(TOM)失重最大;Alternaria sp.产生的MnP酶活最高;Pestalotiopsis sp.产生的CMC和FPA酶活也为最高。实验中6种菌前期的降解速率依赖于纤维素酶CMCase和FPA酶活的高低,后期则由木质素酶和纤维素酶协同作用来决定。依据6种菌的酶生产动力学曲线、TOM失重和降解速率,可将其划分为如下两种功能类型:功能群Ⅰ为纤维素分解菌,包括Alternaria sp.,Penicillum sp.,Cephalosporium sp.和Tricherderma sp.四种;功能群Ⅱ为木质纤维素分解菌,包括Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus两种。我们在实验中也发现,Pestalotiopsis.产生漆酶的活性较高,是一株比较有效地降解木质纤维素底物的菌种。
(2)应用固体发酵方法,研究了Alternaria sp.,Penicillum sp.,Cephalosporiumsp.,Tricherderma sp.,Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 6种土壤半知菌产生的木质纤维素酶包括漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶,羧甲基纤维素酶和滤纸糖酶,在生物降解栓皮栎凋落叶片过程中的重要作用。依据实验结果,可将六种菌株划分为如下两种功能类型:功能群Ⅰ为Alternaria sp.,Penicillum sp,Cephalosporium sp.和Tricherderma sp.四种;功能群Ⅱ为Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus两种。功能群Ⅰ在降解前期(最初的16天)分泌的CMC和FPA的酶活较高,其降解速率也明显的高于功能群Ⅱ,在后期(16~44天),功能群Ⅰ的CMC和FPA的酶活不断降低;功能群Ⅱ在整个降解周期内分泌的漆酶酶活显著的高于功能群Ⅰ,而且在降解后期,功能群Ⅱ能够分泌出活性较高的CMC和FPA。结果表明:功能群Ⅰ为纤维素分解菌,功能群Ⅱ为木质素分解菌。我们在实验中也发现,Pestalotiopsis sp.引起底物的总有机物质(TOM)失重最大(38.2%±3.0%),而且它产生漆酶的活性较高,表明Pestalotiopsis sp.是一株潜在的能够高效生产漆酶的菌种。
(3)在液体振荡发酵条件下,半知菌株Pestalotiopsis sp.,其漆酶分泌明显受到培养基中碳源和氮源的种类及其浓度的影响,最佳的碳源和氮源分别为20 gl-1葡萄糖和10 gl-1酒石酸铵。同时,也探讨了各种不同的诱导因子和抑制因子对Pestalotiopsis sp.生产漆酶的作用。在液体培养两天后(培养基中含20 gl-1葡萄糖和10 gl-1酒石酸铵),添加Cu2+至终浓度2.0mM,能够获得最大的漆酶酶活(32.7±1.7 U ml-1)。但是在第六天之后加入Cu2+(终浓度2.0 mM),Pestalotiopsissp.产生的漆酶酶活明显下降。另外,还研究了Pestalotiopsis sp.的发酵粗酶液对偶氮染料直接蓝Direct Fast Blue B2RL的生物降解,在12小时内(pH 4.0)的脱色率达到88.0±3.2%.结果表明,Pestalotiopsis sp.是工业应用领域内一种新型的漆酶生产菌株。
(4)运用本课题组改进的异硫氰酸胍法,从Pestalotiopsis sp.菌体中提取到的RNA 完整性好,纯度高,完全可用于分子生物学的研究。对不同诱导条件下提取的RNA琼脂糖电泳结果显示,Cu2+能够上调RNA的转录。我们针对漆酶基因中高度保守的四个Cu2+结合位点进一步设计了简并引物进行RT—PCR,5—RACE和3—RACE,克隆Pestalotiopsis sp.的漆酶基因。在今后工作中,运用竞争性定量PCR研究Cu2+在转录水平上对Pestalotiopsis sp.漆酶基因的分子调控机理。