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实验目的：
观察26至45岁之间不同年龄段人体脂肪干细胞体外培养细胞的生长特点。于不同年龄人体腹部皮下取用等量脂肪组织，通过胶原酶消化法分离提取脂肪干细胞，计数原代单核细胞数，记录细胞传代时间，检测细胞周期和细胞增殖活性。通过不同年龄段间ASCs细胞增殖能力的比较，明确不同年龄段间的细胞是否存在增殖能力的差异，为ASCs的临床应用提供更多依据。
实验方法：
1、样本分组。24例患者分组:第一组:26-30岁6例，(27.50±1.52岁);第二组:31-35岁6例，（32.50±1.38岁）;第三组:36-40岁6例，(37.83±1.47岁);第四组:41-45岁6例，(42.67±1.63岁)。
2、脂肪干细胞体外分离、培养。临床于此四组行脂肪抽吸手术的女性患者腹部皮下获取约50-100ml脂肪组织，PBS浸泡转入实验室，无菌条件下强力清洗至少3次，剔除可见的血管和结缔组织，离心后取10ml脂肪组织，Ⅰ型胶原酶37℃条件下消化30min，加入等量含10％FBS的DMEM，1000rpm室温离心5min，弃去上清液及脂肪组织，加入红细胞裂解液，500rpm、4℃离心5min，弃去上清液，以含10％FBS的DMEM重悬沉淀细胞，接种于细胞培养皿。将培养皿置于37℃、体积分数5％CO2培养箱，24小时后观察细胞贴壁状态，并进行第一次换液，以后每周换液2次。待原代细胞长至80％融合，按1∶3传代，每2-3天换一次液，传至第3代细胞备用。
3、原代ASCs有核细胞计数。对从脂肪组织中分离提取的原代细胞进行有核细胞计数，于原代细胞培养至第10d计数收获的有核细胞数，并记录至原代细胞达80％融合时的各样本所需时间。
4、流式细胞仪测定ASCs细胞周期。选取生长至80％融合时的第3代ASCs细胞，消化并离心，以70％冰乙醇吹散后置入4℃条件下过夜固定，用预冷的PBS漂洗离心，以RNaseA37℃水浴处理30min,再加入PI染液4℃避光染色30min，上流式细胞仪488nm检测。
5、MTT法测定ASCs细胞生长曲线。取不同年龄组的第3代ASCs，以5×103的细胞密度接种于96孔板中，按MTT法处理细胞，绘制细胞生长曲线。测定细胞倍增时间(TD)，根据公式TD=t(lg2/lgNt-lgN0)换算出细胞倍增时间。
6、实验所得数据用SPSS17.0软件系统进行方差分析(P＜0.05)。
实验结果：
四组间原代单核细胞计数(P＞0.05)，而细胞生长至80％融合时所需时间第二组与第三组、第三组与第四组比较(P＜0.05);低年龄组细胞传代时间相对较短，细胞生长较迅速，集落范围较大，数目多，且处于增殖期的细胞比例较多，细胞活性较好，而第四组细胞生长较慢，集落形成较小，数量少，第三组细胞处于增殖期的比例明显高于第四组(P＜0.05)，统计学差异显著;细胞活性比较第二组与第三组之间无统计学差异(P＞0.05)，而第二、三组与第四组相比统计学差异显著(P＜0.05)。
实验结论：
不同年龄段人体脂肪干细胞体外培养细胞特性存在差异，随着年龄的增加细胞的增殖能力降低，其中大于40岁者的ASCs增殖能力与年龄较小者相比，降低明显。